阿氏節(jié)桿菌菌株DA—1的厭氧反硝化研究

摘要：阿氏節(jié)桿菌（Arthrobacter arilaitensis）菌株DA-1是一株氨氮降解細(xì)菌，且在有氧及厭氧條件下均具有反硝化作用。通過對該菌的厭氧反硝化條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了碳源、C/N、溫度和初始pH對其反硝化作用的影響。結(jié)果表明，乙酸鈉為最佳的反硝化碳源，當(dāng)C/N為10∶1、溫度為30 ℃、初始pH為7.0時，A. arilaitensis DA-1能獲得最高的反硝化效率，在該條件下，向硝酸鹽模擬污水（NO3--N濃度為25 mg/L）中接入2%（V/V）的A. arilaitensis DA-1菌劑，經(jīng)過48 h的靜置培養(yǎng)，NO3--N的去除量達(dá)到了20.13 mg/L，而此時NO2--N積累濃度僅為0.56 mg/L。

關(guān)鍵詞：阿氏節(jié)桿菌（Arthrobacter arilaitensis）；反硝化作用；硝基氮；亞硝基氮

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）01-0030-03

傳統(tǒng)的生物脫氮包括硝化與反硝化兩個獨立過程，前者主要由自養(yǎng)硝化微生物在有氧條件下進(jìn)行，而后者主要由異養(yǎng)反硝化微生物在厭氧條件下完成，為了加速氨氮處理過程及節(jié)約成本，很多環(huán)境工作者正努力分離高效的兼具異養(yǎng)硝化作用及好氧反硝化作用的微生物[1，2]，以便在獨立反應(yīng)器中由單一微生物完成氨氮廢水的脫氮處理。

有學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)并證實節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）存在異養(yǎng)硝化作用，而且這些節(jié)桿菌均能耐受高濃度的氨氮[3-5]，與自養(yǎng)硝化細(xì)菌比較，異養(yǎng)硝化細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性強、菌體增殖速度快、更利于工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)及工程應(yīng)用[6]。由于節(jié)桿菌屬于專性好氧微生物，而反硝化作用通常在厭氧條件下發(fā)生，因此，節(jié)桿菌的反硝化作用并未引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，僅Carter等[7]在研究土壤及底泥的好氧反硝化作用時，報道了一株節(jié)桿菌在有氧條件下具有明顯的硝酸鹽呼吸作用。

筆者先前從沼液樣本中分離出了一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌（DA-1），該菌株在該沼液樣本中為優(yōu)勢菌群，生理生化實驗及16 S rDNA序列分析（GenBank登錄號：JN885458.1）將其鑒定為阿氏節(jié)桿菌（Arthrobacter arilaitensis），該菌能耐受并降解濃度高達(dá)1 000 mg/L以上的氨氮廢水[8]，與目前文獻(xiàn)報道的最高水平相當(dāng)[9，10]。此外，還發(fā)現(xiàn)A. arilaitensis DA-1在好氧及厭氧條件下均表現(xiàn)出典型的反硝化特征，表明該菌株在生物脫氮方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究主要探討其厭氧條件下的反硝化作用及影響因素。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試菌種為A. arilaitensis DA-1，為專性好氧革蘭氏陰性細(xì)菌，分離于南京工業(yè)大學(xué)沼氣工作站沼液樣本，具有硝化及反硝化能力。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物 5.00 g/L、胰蛋白胨 10.00 g/L、氯化鈉 10.00 g/L，pH 7.0～7.2。

硝酸鹽培養(yǎng)基：NaNO3 0.30 g/L、NaCl 10.00 g/L、KH2PO4 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.50 g/L、ZnSO4·7H2O 0.22 g/L、CuSO4·5H2O 0.08 g/L、MnSO4·4H2O 2.03 g/L、Na2MoO4·2H2O 1.26 g/L。該培養(yǎng)基中硝基氮（NO3--N）的濃度為25 mg/L，碳源種類及濃度根據(jù)實驗要求選擇性添加。

1.3 接種劑制備

挑取A. arilaitensis DA-1單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基活化，活化好的菌液按照1%（V/V，下同）的接種量轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基（250 mL三角瓶，裝液量為50 mL），30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min下離心3 min，去上清液，菌體細(xì)胞重懸于無菌生理鹽水至終濃度為1×109 CFU/mL，備用。

1.4 反硝化條件的優(yōu)化

以2%的接種量接種A. arilaitensis DA-1菌劑至各種硝酸鹽培養(yǎng)基（200 mL培養(yǎng)基分裝至250 mL三角瓶，無菌石蠟油覆蓋液體表面，橡膠塞封閉瓶口），在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，間隔8 h取樣測定各樣本中的硝基氮及亞硝基氮（NO2--N）含量。

反硝化條件的優(yōu)化共設(shè)4組實驗，分別為①碳源選擇實驗：以乙酸鈉、甘油、丁二酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖作為備選碳源，并將C/N 質(zhì)量比控制在8∶1；②最佳C/N實驗：以乙酸鈉作為碳源，控制C/N分別為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1及12∶1；③溫度影響實驗：分別設(shè)置溫度為20、25、30、35及40 ℃；④pH影響實驗：分別設(shè)置pH為5.0、6.0、7.0、8.0及9.0。每組實驗均設(shè)置3個平行重復(fù)。

1.5 硝基氮及亞硝基氮的濃度測定

NO3--N濃度采用紫外分光光度法（GB/T 5750.5—2006）測定；（NO2--N濃度采用N-（1-萘基）乙二胺光度法（GB 7493—87）測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對A. arilaitensis DA-1反硝化作用的影響

反硝化過程需要有機碳源作為硝酸鹽呼吸的電子供體及滿足細(xì)胞生長[11]。通過分析不同碳源條件下A. arilaitensis DA-1的硝酸鹽還原能力及亞硝酸鹽積累情況，結(jié)果表明，乙酸鈉、甘油、檸檬酸鈉和葡萄糖均能作為有效的電子供體，接種培養(yǎng)48 h后，菌株DA-1對NO3--N降解量分別為19.67、5.04、14.82、9.32 mg/L，而丁二酸鈉則不能被菌株DA-1利用參與反硝化反應(yīng)（圖1A）；在整個反硝化過程中，NO2--N濃度均呈現(xiàn)先上升再逐漸降低的趨勢，其中，乙酸鈉作為碳源時NO2--N殘留濃度最低（1.19 mg/L），甘油和檸檬酸鈉作為碳源時次之，NO2--N殘留濃度分別為2.02 mg/L和1.71 mg/L，葡萄糖作為碳源時NO2--N殘留濃度最高（2.34 mg/L）（圖1B）。因此，選擇乙酸鈉作為A. arilaitensis DA-1反硝化反應(yīng)的最佳碳源。

2.2 C/N對A. arilaitensis DA-1反硝化作用的影響

以乙酸鈉作為碳源，檢測了不同C/N條件下A. arilaitensis DA-1反硝化作用，結(jié)果（圖2）表明，隨著C/N的增大，菌株DA-1對硝酸鹽的降解率也隨之提高，當(dāng)C/N為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1及12∶1時，NO3--N降解量分別為5.56、10.19、19.04、19.59、20.13及20.19 mg/L。反硝化過程往往由于碳源不足，難以將NO3--N徹底還原為氣態(tài)氮，從而導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累。由圖2可以看出，當(dāng)C/N控制在6∶1～10∶1時，雖然菌株DA-1對硝酸鹽降解率變化不大，但NO2--N濃度隨著C/N的增大而逐漸降低，而當(dāng)C/N大于10∶1時，NO3--N及NO2--N濃度變化均不再明顯，從節(jié)約成本的角度考慮，后續(xù)實驗選擇10∶1作為A. arilaitensis DA-1反硝化反應(yīng)的最佳C/N。

2.3 溫度對A. arilaitensis DA-1反硝化作用的影響

以乙酸鈉作為碳源、C/N為10∶1時，考察了溫度變化對A. arilaitensis DA-1反硝化作用的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，當(dāng)溫度控制在30 ℃及35 ℃時，菌株DA-1能獲得較高的反硝化效率，其中30 ℃為最適反應(yīng)溫度，其他溫度條件下A. arilaitensis DA-1也能進(jìn)行部分反硝化作用，但硝酸鹽去除量較低并存在較高的亞硝酸鹽積累，因此后續(xù)實驗選擇30 ℃作為A. arilaitensis DA-1反硝化反應(yīng)的最佳溫度。

2.4 初始pH對A. arilaitensis DA-1反硝化作用的影響

反硝化反應(yīng)是個產(chǎn)堿過程，初始pH對反硝化效率及菌體生長均有影響。以乙酸鈉作為碳源、C/N為10∶1、溫度為30 ℃時，考察不同初始pH對A. arilaitensis DA-1反硝化作用的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，當(dāng)體系的初始pH為7.0時，菌株DA-1的反硝化效率最高，NO3--N的去除量為20.13 mg/L，而NO2--N的積累濃度僅為0.56 mg/L；偏酸或者偏堿都會導(dǎo)致其反硝化效率的降低，尤其是在酸性條件下，體系中亞硝酸鹽的殘留濃度過高，當(dāng)初始pH低至5.0時，NO2--N濃度達(dá)到了5.93 mg/L。

3 討論

通過碳源選擇及對C/N、溫度及初始pH的優(yōu)化，獲得了A. arilaitensis DA-1最佳的厭氧反硝化條件是乙酸鈉為碳源、C/N為10∶1、溫度為30 ℃、初始pH為7.0。

反硝化細(xì)菌多屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，革蘭氏陽性細(xì)菌通常被認(rèn)為不具有反硝化作用[12]，自20世紀(jì)70年代以來，在已發(fā)現(xiàn)的反硝化革蘭氏陽性細(xì)菌中，多數(shù)屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）及棒桿菌屬（Corynebacterium）[13]，目前未見節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的厭氧反硝化報道。

在研究A. arilaitensis DA-1的厭氧反硝化作用時，采取了無菌石蠟油封閉培養(yǎng)基液面并采取靜置培養(yǎng)的方式，將培養(yǎng)基的溶解氧控制在極低水平，A. arilaitensis DA-1菌體細(xì)胞只能痕量生長（數(shù)據(jù)未列出），因此，在分析硝酸鹽及亞硝酸鹽濃度變化時，排除了菌體同化作用的影響，硝酸鹽濃度的降低可以認(rèn)為主要是由于反硝化作用引起的；在好氧條件下（搖床培養(yǎng)，150 r/min），A. arilaitensis DA-1也表現(xiàn)出了典型的反硝化特征（數(shù)據(jù)未列出）；此外，A. arilaitensis DA-1在其分離的沼液樣本中為主要的氨氮降解菌群，這些研究結(jié)果表明節(jié)桿菌（Arthrobacter）在自然界氮素循環(huán)中也許發(fā)揮著重要作用，值得環(huán)境科研工作者深入研究。

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