高效液相色譜熒光法測定胡椒中的阿維菌素

摘要：建立以高效液相色譜熒光（HPLC-FLD）法測定胡椒（Piper nigrum L.）中阿維菌素含量的方法。樣品用乙腈提取，經氨基柱凈化，衍生后，以HPLC-FLD法分析。結果表明，該法在添加回收濃度為0.005，0.010和0.050 mg/kg 3個不同添加水平的回收率為95%～103%，其檢出限為0.005 mg/kg。

關鍵詞：高效液相色譜熒光法；阿維菌素；殘留；胡椒（Piper nigrum L.）

中圖分類號：O657.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0425-03

阿維菌素（Abamectin，AVM）是由鏈霉菌發酵產生的大環內酯類抗生素，屬昆蟲神經毒劑，主要干擾神經生理活動，刺激釋放γ-氨基丁酸，而γ-氨基丁酸對節肢動物的神經傳導有抑制作用，害蟲與藥劑接觸后即出現麻痹中毒而死，無內吸性[1]。由于具有殺蟲性強以及殺蟲譜廣等特點，被廣泛用于蔬菜、果樹、棉花和花卉等作物上[2]。

Malanikova等曾使用TLC法檢測阿維菌素，在硅膠薄層板上涂上熒光指示劑，用于樣品檢測。但TLC與高效液相色譜（HPLC）法相比較，靈敏度低，一般只作定性分析，很少用于殘留檢測[3]。根據阿維菌素類藥物的共軛二烯結構在240～250 nm處有強烈的紫外吸收，常采用液相色譜-紫外檢測分析方法[4，5]。但另一方面，阿維菌素類藥物在體內最小有效濃度低于紫外檢測器對其最低檢測限（1～2 ng/mL）[6]。與紫外檢測器相比，熒光檢測器（Fluorescence detector，FLD）的靈敏度約高100倍，對痕量分析特別適用。而且只有具有對稱共軛和非強離子化的化合物才能發射熒光，因此HPLC-FLD法的基質干擾較少。

由于AVM本身沒有對稱共軛結構，不能直接用熒光檢測器檢測，而只有經衍生后生成具有對稱共軛的苯環結構才能發射熒光，其在血漿中的AVMs檢測限可達0.02 ng/mL[7]。由于胡椒（Piper nigrum L.）基質復雜，含有大量的揮發油、胡椒堿、粗脂肪、粗蛋白，對液相色譜柱及檢測結果產生影響，因此，本試驗將圍繞建立胡椒中阿維菌素的檢測方法展開。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測器（Waters，美國），N-EVAP氮吹儀（Organomation，美國），旋轉蒸發儀（Heidolph，德國）等。

1.2 主要試劑和材料

甲醇（色譜純），乙腈，二氯甲烷，正己烷，氯化鈉（140 ℃烘烤4 h）均為分析純；阿維菌素標準品（94.7%）等。

NH2-氨基固相萃取柱（Agilent，美國）。

標準儲備液的配制：準確稱取阿維菌素標準品0.1 g于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成1.0 mg/mL的標準儲備液。將上述標準儲備液置于4 ℃冰箱保存。

衍生制劑A：在一具塞試管中加入3.6 mL N， N-二甲基甲酰胺和0.4 mL 1-甲基咪唑，混勻后立即置于冰浴中冷卻1 min，緩緩加入0.6 mL三氟乙酸酐，搖勻，現配現用。

衍生制劑B：在一具塞刻度試管中加入3 mL甲醇和0.2 mL濃氨水，搖勻。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取 稱取10 g胡椒樣品，先后加入5 mL和40 mL乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜止10 min，使乙腈相和水相分層[8]。

1.3.2 凈化 取20 mL上清液，轉入150 mL分液漏斗后，加入20 mL乙腈飽和的正己烷，充分混勻，分層，取下層于150 mL旋轉蒸發瓶中，37 ℃水浴旋轉蒸至近干。固相萃取淋洗液為甲醇-二氯甲烷（95/5， V/V，下同），先用4 mL預淋，當溶劑液面到達吸附層表面時，立即加入樣品溶液，用10 mL具塞刻度試管收集洗脫液，再用2 mL甲醇-二氯甲烷洗燒杯后過柱，并重復1次。將試管置于40 ℃水浴氮吹。

1.3.3 衍生 向試管中加入0.2 mL衍生試劑A，超聲1 min后，于30 ℃水浴1 h，并不時搖動。取出后再加入0.1 mL衍生試劑B，搖勻。并于30 ℃水浴0.5 h，冷卻至室溫。加入2.5 mL甲醇，振蕩，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.4 色譜分析 流動相為甲醇-水溶液（9/1，V/V），Kinetex C18（50 mm ×4.6 mm， 2.6 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，熒光激發波長為365 nm，發射波長為475 nm，進樣量5 μL，流量0.6 mL/min。

1.3.5 添加回收試驗 在空白樣品中添加阿維菌素標樣（標樣純度為94.7%），按前述分析方法測定回收率。

2 結果與分析

在上述儀器條件下，阿維菌素的保留時間為6.538 min，標準溶液色譜圖見圖2，采用外標法定量，R2=0.997 1，最低檢測限為0.005 0 mg/kg。其中，圖1-圖4為衍生前氮吹全干情況下。

在添加濃度為0.005、0.010、0.050 mg/kg范圍內，胡椒樣品的添加回收率見表1。由表1可知，添加回收率平均值為95%～103%，變異系數為5.1%～9.3%，滿足農藥殘留登記的要求[9]。

在衍生后氮吹近干時，其色譜圖見圖5。由圖5可知，測定加標濃度為0.050 mg/kg的樣品時，測得僅為0.001 mg/kg，回收率不足20%，未達到農藥殘留分析的要求。

3 結論

本試驗建立了胡椒中阿維菌素測定方法，通過乙腈提取，再用乙腈飽和的正己烷進行液液萃取去除胡椒中的油脂，以NH2小柱凈化，二氯甲烷-甲醇洗脫，再通過避光衍生，即可進行色譜分析。需要注意的是，在衍生之前的氮吹過程中，一定要保證待測樣品完全吹干，可保證回收率為95%～103%，達到農藥殘留分析的要求。

參考文獻：

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[2] 王險峰.進口農藥應用手冊[M].北京：中國農業出版社，2000. 64-66.

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[9] NY/T 788-2004. 農藥殘留試驗準則[S].