植物異黃酮合酶及其基因的研究進展

摘要：異黃酮合酶（IFS）具有催化黃烷酮的活性，同時也是異黃酮生物合成代謝途徑中的關鍵酶。詳細闡述了植物異黃酮合酶及其基因的研究進展。

關鍵詞：異黃酮合酶（IFS）；異黃酮合酶基因；植物

中圖分類號：Q946 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0258-04

異黃酮是由類黃酮生物合成代謝途徑的中間產物黃烷酮在特定酶的作用下合成的，而催化黃烷酮進入異黃酮合成代謝途徑的第一個反應的酶就是異黃酮合酶（Isoflavone synthase，IFS），同時也是異黃酮生物合成代謝途徑的關鍵酶[1]。

1 異黃酮合酶的研究進展

20世紀60年代，科學家應用放射性標記前體技術已經發現異黃酮的生物合成的實質是黃烷酮B環移位重排現象造成的。此反應具有一定的立體專一性，一般只有（2S）-黃烷酮才可生成異黃酮，其直接的作用前體是甘草素（Liquiritigenin，7，4′—二羥基黃烷酮）和柚皮素（Naringein，5，7，4′—三羥基黃烷酮），產物是大豆苷元（Daidzein，7，4′—二羥基異黃酮）或染料木素（Genistein，5，7，4′—三羥基異黃酮）[2]。IFS催化此反應，但是在細胞中含量較低，且不穩定，1984年首次在大豆懸浮培養細胞微粒體中檢測出IFS可催化黃烷酮B環從C2位移位到C3位且有反應活性的現象，而酶反應主要依賴O2和NADPH，但真菌激發子（Elicitor）處理樣品后其活性可提升7～10倍[2]。之后，Kochs等[3]和Hashim等[4]的研究發現，在大豆和三裂葛懸浮細胞微粒體中黃烷酮生成異黃酮進行了兩步反應。第一步反應是在NADPH和O2的參與下，IFS催化甘草素或柚皮素的B環移位生成2-羥基異黃酮；第二步反應是由異黃酮2-脫水酶催化脫水或2-羥基異黃酮自發生成大豆苷元或染料木素[5]，研究發現第一步反應中酶的活性可完全被不同的細胞色素P450蛋白抑制劑而抑制，NADPH：P450還原酶的體外重組體系和P450可將甘草素轉化為2-羥基異黃酮[6]，表明IFS是一種依賴于P450的單氧酶。現今，有兩種關于IFS可催化黃烷酮B環移位重排反應機制的解說，一種是黃烷酮1，2重排機制[4]，認為反應首先是在C3位發生脫氫現象，之后發生1，2重排，B環才從C2位遷移到C3位，而C2位羥基化生成了2-羥基異黃酮；另一種是離子機制[7]，認為B環的移位重排現象是通過形成烯醇式環氧化物而進行的。由于此離子機制涉及黃烷酮4′-羥基的去質子化和烯醇式環氧化物過渡分子4′-羥基的重新質子化兩個反應，其疑問較大，因為更多的人傾向于第一種解說，但是反應的立體專一性有待進一步闡明。

近幾年，IFS基因已被克隆，并在酵母中成功表達，從而實現了IFS酶蛋白簡單純化，為進一步深入分析IFS所參與的反應及其作用機理奠定基礎[8]。Kim等[9]在酵母中表達了白三葉草IFS，并催化不同，研究表明酶活性是依賴C2和C3的飽和鍵，而C3不被羥基化和C7-OH存在是進行酶反應的兩個必需的條件。通過已知的P450蛋白X衍射結構信息分析發現，組成P450蛋白活性中心是高度保守α-螺旋和β-折疊的結構，借助計算機生物信息學方法模擬結構，Sawada等[8]對在酵母中表達的甘草IFS進行了定點突變研究，結果表明酶蛋白活性中心的α-螺旋上的Ser310和β-折疊上的Lys375是酶活性所必需的結構， 黃烷酮C7-OH和Lys的ε-NH4+反應錨定了底物，確保了黃烷酮生成異黃酮過程中B環的遷移，如果Lys突變為Thr，則失去活性，而Ser為B環從C2到C3的遷移提供了空間保證，測定出IFS反應的最適pH為7～8，Km約為8 μmol/L。

2 異黃酮合酶基因的研究進展

2.1 IFS基因序列的研究

1997年，Akashi等[10]利用P450的保守序列的特性，首先采用PCR方法從甘草的培養細胞中克隆出8個P450的cDNA片段（Ge-1到Ge-8）。之后對Ge-5全長cDNA的陽性克隆的研究表明，Ge-5可編碼（2S）-黃烷酮-2-羥基化酶（F2H）[11]。由于研究發現F2H和IFS是作用同一黃烷酮底物且進行不同分支代謝合成途徑的2個酶，同時也發現了細胞微粒體膜上同時具有F2H和IFS活性，Akashi等[12]推測F2H和IFS可屬于同一P450家族。因為甘草Ge-5和Ge-8同屬于CYP93家族，所以用Ge-8作為探針從已誘導了6～12 h的甘草細胞cDNA文庫中克隆出了Ge-8全長cDNA （CYP93C2，AB023636），并在酵母中成功表達，試驗證明了CYP93C2編碼蛋白可催化柚皮素或甘草素生成染料木素或大豆苷元，同時發現CYP93C2蛋白是IFS，同時Northern印跡法表明了在甘草培養細胞中經YE誘導6 h后IFS基因表達水平達到最高峰，并檢測到異黃酮的含量也隨之開始增加直至12 h達到最高峰。利用PCR技術，Kim等[9]克隆到白三葉草IFS全長cDNA（AY253284）， Shimada等[13]克隆到百脈根的IFS全長cDNA（LjCYP-1，AB024931）。

與此同時，Staele等[14]利用功能基因組學的研究方法，根據P450的保守序列特性，在真菌誘導下的大豆下胚軸EST文庫中篩選出1條序列，研究發現該序列屬于CYP93家族的序列，并克隆出全長cDNA（CYP93ClvZ，AF135484），序列分析發現CYP93ClvZ與大豆CYP93CI基本相同，在ORF中僅有3個氨基酸序列差異。將CYP93ClvZ轉入到昆蟲細胞進行表達分析，分離出NADPH、甘草甜素與微粒體一起孵育，通過HPLC、GC-MS驗證有2-羥基異黃酮生成，充分證實CYP93ClvZ編碼的蛋白是IFS。20世紀末，美國杜邦公司利用EST篩選技術，從誘導的栽培大豆葉片cDNA文庫中克隆出了IFS全長cDNA（AF195798），并以此cDNA序列設計引物，通過RT-PCR技術分別從紫花首蓓（Medicago sativa，AFl95800，AF195801，AF195802）、毛苔子（Vicia villosa，AF195803）、小扁豆（Lens culinarys，AF195804，AF195805）、綠豆（Vigna radiata ，AF195806，AF195807，AF195808，AF195809）、紅三葉草（Trifolium patense，AF195810，AF195811）、雪豆（Pisum sativm，AF195812）、羽扇豆（Lupinus albus，AF195813）、白三葉草（Trifolium repens，AF195814，AF195815）等9種植物中克隆出IFS全長cDNA[15]。2005年Cooper等[16]從昆蟲誘導子處理后的雪豆的豆莢中克隆出了IFS基因（CYP93C18），Kim等[17]比較分析了18個不同類型的大豆栽培品種的IFS基因結構。同年，羅建平等[18]也從高含量合成異黃酮的豆科植物懷槐（Maackiaamurensis）中克隆出IFS的cDNA片段，長度800 bp，又進行了全長cDNA的克隆。

目前，根據已經克隆出的15種豆科植物中IFS的cDNA序列和功能分析（httpl//www.ncbi.dm.nih.gov），IFS基因的拷貝數為1～3個[13，15]，編碼區中含有135～218 bp的內含子[15，19]，不同植物中的該基因全長cDNA序列高度保守，在400～600 bp和800～

1 200 bp兩個區段完全相同，而由cDNA推測的蛋白氨分子質量約為59 ku，pI約為8.95，氨基酸序列的同源性在92%～97%之間[15]。研究發現，所有異源表達的IFS都具有催化合成異黃酮的功能，但來源不同的IFS催化柚皮素或甘草素生成染料木素或大豆苷元的能力有所差異。2004年，Subramanian等[19]分析了栽培大豆IFS基因的啟動子結構，發現在

-125 bp和-264 bp處存在TATABox和CAATBox，而抑制子和增強子分別是在-537 bp和-887bp處，同時具有決定該基因在種子中特異表達的激發子響應序列EIRE（-565 bp）和SEF4結合域（-665 bp），在非豆科的雙子葉和單子葉植物中IFS基因啟動子可啟動GUS等基因的正常表達，具有組織專一性，并受茉莉酸甲酯、水楊酸、UV、固氮菌等因素的誘導。

2.2 IFS基因表達調控的研究

IFS基因結構的研究及其克隆為利用分子生物學手段修飾豆科植物異黃酮合成代謝途徑和使非豆科植物能夠合成適量的異黃酮奠定了研究的理論基礎。2000年，美國杜邦公司首次把栽培大豆的IFS基因轉入到自身不能合成異黃酮的模式植物擬南芥中，并在轉基因陽性植株的莖和葉片中檢測到IFS基因表達的mRNA，而染料木素含量可達2 μg/g[15]。因為在所有的植物中都有合成異黃酮所需的底物柚皮素和甘草素，同時它們是類苯丙烷合成代謝途徑的中間產物，所以轉基因植株中的異源IFS同樣利用這些物質作為底物合成異黃酮。

由于轉基因植株中合成的異黃酮含量較低，進一步深入研究分析用轉栽培大豆IFS基因的煙草、擬南芥和玉米細胞系對影響合成異黃酮含量高低的因子。在轉基因煙草中，通過Northern、Western印跡和微粒體酶活性體外試驗檢測，結果都表明在葉片和花中都有IFS基因的表達產物，但只有在花中可檢測出染料木素的積累，而葉片中無異黃酮的合成[20]。研究發現煙草花中花青苷（Anthocyanins）的含量是葉片的130多倍，表明不是異源表達的IFS活性自身限制了染料木素的合成，而是底物的獲得應該是轉基因植株能否促使異黃酮合成的制約因素，這是因為煙草花中花青素合成代謝途徑中組織特異性的激活，可使已表達的IFS競爭代謝中間物柚皮素從而合成染料木素成為一種可能。在轉基因擬南芥中，研究發現UV可增強類苯丙烷途徑中合成花青苷且同時合成異黃酮的能力，同樣證明了上述結論的正確性[20]。在轉基因玉米的懸浮細胞中，也發現并證實轉基因植物中IFS可依賴增強以提供中間代謝物或類苯丙烷途徑的激活從而有效合成異黃酮。

由于玉米細胞中缺乏轉錄因子R（myc-type） 和C1（myb-type）而不能合成花青苷，當在C1的DNA激活區和結合區之間插入R構成融合轉錄因子CRC后，再將其轉入到不能合成異黃酮的轉IFS基因玉米細胞中，該轉基因細胞不僅可合成花青苷，而且還可合成異黃酮[16，20]。而提高轉基因植株合成較高含量異黃酮的另一個策略是切斷與IFS競爭共同底物的分支途徑。二羥基黃酮醇還原酶（DFR） 和黃烷酮-3-羥化酶（F3H）是與IFS競爭相同底物柚皮素分別合成黃烷醇和花青苷的分支酶。Liu等[21]將栽培大豆的IFS基因轉入到擬南芥DFR和F3H的雙突變體tt3/tt6中，因為2個分支途徑被阻斷，所以轉基因植株中染料木素含量可提高5～30倍。Yu等[22]對栽培大豆DFR的活性進行了抑制，同樣也獲得相似的促進效果。

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