“冷俊”槭查爾酮異構(gòu)酶基因CHI片段克隆及序列分析

摘要：以槭樹(shù)品種“冷俊”為試材，利用RT-PCR技術(shù)，根據(jù)GenBank中登錄的相關(guān)物種查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，提取其秋季變色期葉片中的總RNA并擴(kuò)增出CHI基因的cDNA片段。測(cè)序結(jié)果表明，該片段長(zhǎng)553 bp，編碼183個(gè)氨基酸。序列分析表明，該片段與龍眼、橄欖、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上，證明已成功克隆到槭樹(shù)變色期葉片CHI基因的cDNA片段，在GenBank中登錄號(hào)為KC121346。

關(guān)鍵詞：槭樹(shù)；CHI基因；克??；序列分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）04-0012-04

1材料與方法

11材料

試驗(yàn)于2011年11月在山東省果樹(shù)研究所觀賞園藝室進(jìn)行，以槭樹(shù)品種“冷俊”的秋季變色葉片為試材。于11月份采集葉片，迅速放入液氮中冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃冰箱中備用。

12試劑

PCR kit、cDNA kit購(gòu)自大連寶生物工程公司，PCR引物合成及測(cè)序工作則由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。

13方法

131葉片總RNA提取參考招雪晴等[10]的方法，采用改良CTAB法提取槭樹(shù)葉片總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD值。

反應(yīng)條件：98℃變性30 s，然后按98℃ 10 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s進(jìn)行35輪循環(huán)反應(yīng)，最后72℃延伸6 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

134序列分析通過(guò)BLASTN 進(jìn)行同源性比對(duì)分析。用DNAMAN 60軟件分析DNA 序列并進(jìn)行多序列比對(duì)，翻譯出氨基酸序列后在BLASTP中搜索相似性高的蛋白質(zhì)序列。

2結(jié)果與分析

21槭樹(shù)葉片總RNA的制備

利用改良的CTAB法提取槭樹(shù)葉片的RNA，測(cè)量其OD值，結(jié)果為201，表明蛋白污染少。用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，28S、18S條帶較清晰，無(wú)降解，說(shuō)明所提取的RNA純度和完整性較好，無(wú)DNA污染，符合cDNA合成的要求。

22槭樹(shù)葉片CHI基因片段的克隆與測(cè)序

利用設(shè)計(jì)好的簡(jiǎn)并引物，以槭樹(shù)葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了與預(yù)計(jì)片段大小一致的片段（圖1），測(cè)序后的cDNA片段為553 bp，編碼183個(gè)氨基酸（圖2）。

3結(jié)論與討論

Druka 等[11]曾報(bào)道CHI cDNA序列的同源性一般為 42%～65%， 不同物種或同一物種不同類(lèi)型的CHI也有較大的差異，給同源克隆CHI帶來(lái)一定的困難。本試驗(yàn)表明，用于擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)是同源克隆成功的重要因素，不合適的引物無(wú)擴(kuò)增條帶或產(chǎn)生彌散，而保守性好、GC含量高的引物克隆結(jié)果較好。故選擇保守區(qū)間GC含量高的區(qū)域有利于同源克隆試驗(yàn)的成功。

目前研究結(jié)果表明，CHI是影響植物顏色形成的重要酶之一，會(huì)直接影響植物顏色表達(dá)。目前對(duì)CHI基因的研究主要在序列分析、基因克隆及轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控等方面。對(duì)CHIA和CHIB啟動(dòng)子DNA序列研究表明，啟動(dòng)子中有高度保守的序列37 bp[12]。菜豆和矮牽牛的氨基酸組成與從豌豆胚軸上克隆的CHI基因氨基酸序列顯示較高的同源性[13]。現(xiàn)已在多種植物中克隆到CHI基因，并開(kāi)始在轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用。Muir等[1]曾將矮牽牛CHI基因轉(zhuǎn)入番茄并獲得了轉(zhuǎn)基因番茄，結(jié)果顯示番茄果皮中黃酮類(lèi)含量增加了78倍，果肉中黃烷醇增加了21倍。將CHS和CHI基因?qū)氚珷颗?，轉(zhuǎn)基因植株花的顏色發(fā)生了改變，花器官也發(fā)生了變異[14]。洋蔥中CHI基因突變引起CHI酶活性的喪失，導(dǎo)致洋蔥變?yōu)榻鹕玔15]。對(duì)CHI基因的研究，前人大部分以蔬菜、水果、花卉等物種為試材，但對(duì)木本園林植物CHI基因的研究較少，本試驗(yàn)利用同源克隆的方法，首次以槭樹(shù)為試材克隆出CHI基因cDNA片段，為下一步克隆槭樹(shù)CHI基因cDNA全長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)，該基因在槭樹(shù)秋季變色過(guò)程中起何種調(diào)節(jié)作用，還有待于進(jìn)一步研究。

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