“冷俊”槭查爾酮異構酶基因CHI片段克隆及序列分析

摘要：以槭樹品種“冷俊”為試材，利用RT-PCR技術，根據GenBank中登錄的相關物種查爾酮異構酶基因（CHI）的保守序列設計簡并引物，提取其秋季變色期葉片中的總RNA并擴增出CHI基因的cDNA片段。測序結果表明，該片段長553 bp，編碼183個氨基酸。序列分析表明，該片段與龍眼、橄欖、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上，證明已成功克隆到槭樹變色期葉片CHI基因的cDNA片段，在GenBank中登錄號為KC121346。

關鍵詞：槭樹；CHI基因；克??；序列分析

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）04-0012-04

1材料與方法

11材料

試驗于2011年11月在山東省果樹研究所觀賞園藝室進行，以槭樹品種“冷俊”的秋季變色葉片為試材。于11月份采集葉片，迅速放入液氮中冷凍，帶回實驗室放入-80℃冰箱中備用。

12試劑

PCR kit、cDNA kit購自大連寶生物工程公司，PCR引物合成及測序工作則由上海生工生物工程技術服務有限公司進行。

13方法

131葉片總RNA提取參考招雪晴等[10]的方法，采用改良CTAB法提取槭樹葉片總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度計測量OD值。

反應條件：98℃變性30 s，然后按98℃ 10 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s進行35輪循環反應，最后72℃延伸6 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。PCR產物送上海生工測序。

134序列分析通過BLASTN 進行同源性比對分析。用DNAMAN 60軟件分析DNA 序列并進行多序列比對，翻譯出氨基酸序列后在BLASTP中搜索相似性高的蛋白質序列。

2結果與分析

21槭樹葉片總RNA的制備

利用改良的CTAB法提取槭樹葉片的RNA，測量其OD值，結果為201，表明蛋白污染少。用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，28S、18S條帶較清晰，無降解，說明所提取的RNA純度和完整性較好，無DNA污染，符合cDNA合成的要求。

22槭樹葉片CHI基因片段的克隆與測序

利用設計好的簡并引物，以槭樹葉片cDNA為模板進行PCR擴增，得到了與預計片段大小一致的片段（圖1），測序后的cDNA片段為553 bp，編碼183個氨基酸（圖2）。

3結論與討論

Druka 等[11]曾報道CHI cDNA序列的同源性一般為 42%～65%， 不同物種或同一物種不同類型的CHI也有較大的差異，給同源克隆CHI帶來一定的困難。本試驗表明，用于擴增的引物設計是同源克隆成功的重要因素，不合適的引物無擴增條帶或產生彌散，而保守性好、GC含量高的引物克隆結果較好。故選擇保守區間GC含量高的區域有利于同源克隆試驗的成功。

目前研究結果表明，CHI是影響植物顏色形成的重要酶之一，會直接影響植物顏色表達。目前對CHI基因的研究主要在序列分析、基因克隆及轉基因表達調控等方面。對CHIA和CHIB啟動子DNA序列研究表明，啟動子中有高度保守的序列37 bp[12]。菜豆和矮牽牛的氨基酸組成與從豌豆胚軸上克隆的CHI基因氨基酸序列顯示較高的同源性[13]?，F已在多種植物中克隆到CHI基因，并開始在轉基因植物中應用。Muir等[1]曾將矮牽牛CHI基因轉入番茄并獲得了轉基因番茄，結果顯示番茄果皮中黃酮類含量增加了78倍，果肉中黃烷醇增加了21倍。將CHS和CHI基因導入矮牽牛，轉基因植株花的顏色發生了改變，花器官也發生了變異[14]。洋蔥中CHI基因突變引起CHI酶活性的喪失，導致洋蔥變為金色[15]。對CHI基因的研究，前人大部分以蔬菜、水果、花卉等物種為試材，但對木本園林植物CHI基因的研究較少，本試驗利用同源克隆的方法，首次以槭樹為試材克隆出CHI基因cDNA片段，為下一步克隆槭樹CHI基因cDNA全長奠定基礎，該基因在槭樹秋季變色過程中起何種調節作用，還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] Muir S R， Collins G J， Robinson S， et al Overexpression of petunia chalcone is omerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols[J] Nature Biotechnology， 2001， 19： 470-474

[2]周發俊，王逸群，陳由強植物查爾酮異構酶分子生物學研究進展（綜述）[J] 河北科技師范學院學報，2008，22（1）：73-75

[3]Vantunen A J， Koes R E， Spelt C E， et al Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrid： coordinate， light-regulated and differential erpression of flavonoid genes[J] EMBO J， 1988， 7： 1257-1263

[4]Vantunen A J， Hartman S A， Mol J N Regulation of chalcone isomerase （CHI） gene expression in Petunia hydria： the use of alternative promoters in corolla， anthers and pollen[J] Plant MolBiol， 1989， 12： 539-551

[5]馬春雷，趙麗萍，張亞麗，等 茶樹查爾酮異構酶基因克隆及序列分析[J]茶葉科學，2007，27（2）：127-132

[6]李軍，李洪清，李美茹 大花美人蕉查爾酮異構酶基因的cDNA克隆和序列分析[J] 植物生理學通訊，2006，42（3）：449-453

[7]劉春霞，王玥，崔明昆，等 燈盞花CHI的克隆及其生物信息學分析[J] 武漢植物學研究，2010，28（6）：682-690

[8]孟慶法，田朝陽，高紅莉，等 河南省槭樹科植物資源及開發利用研究[J] 河南農業大學學報，2009，43（1）：65-69

[9]李倩中，蘇家樂，陳尚平，等 三種槭樹科植物光合特性日變化研究[J] 安徽農學通報，2007，13（6）：20-21

[10]招雪晴，苑兆和，陶吉寒，等 紅花石榴二氫黃酮醇還原酶（DFR）基因cDNA片段克隆及序列分析[J] 山東農業科學，2012，44（2）：1-4

[11]Druka A， Kudrna D， Rostoks N， et al Chalcone isomerase gene from rice （Oryza sativa） and barley （Hordeum vulgare）： physical， genetic and mutation mapping[J] Gene，2003， 302（1-2）： 171-178

[12]Vandermeer I M， Sttam M E， Vantunen A J， et al Antisense inhibition of flavonoid biosynthesis in petunia anthers results in male sterility[J] Plant Cell，1992， 4： 253

[13]Wood A J， Davies E A cDNA encoding chalcone isomerase from aged pea epicotyls [J] Plant Physiol，1994， 104（4）： 1465-1466

[14]Pelletierm K， Burbulis I E， Winkle-shirley B Disruption of specific flavonoid genes enhances the accumulation of flavonoid enzymes and end-products in Arabidopsis seedlings [J] Plant MolBiol，1999， 4（1）： 45-54

[14]祝欽瀧 轉查爾酮異構酶（CHI）基因矮牽?；ㄉ淖兗捌浠ㄆ鞴僮儺惖难芯縖D]重慶：西南農業大學， 2004

[15]Kim S， Jones R， Yoo K S， et al Gold color in onions （Allium cepa）： a natural mutation of the chalcone isomerase gene resulting in a premature stop codon [J] MolGenetGenomics， 2004， 72（4）： 411-419