甜瓜蔗糖合成酶基因（CmSS1）反義表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳

摘要：以BamH Ⅰ和Sal Ⅰ 雙酶切pMD18-T-CmSS1和表達(dá)載體pBI121，再用T4 DNA連接酶將回收的目的片段反向與pBI121連接。結(jié)果證明，CmSS1反向插入到 pBI121 中， 得到了 pBI121-CmSS1的重組質(zhì)粒；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反義CmSS1基因轉(zhuǎn)化甜瓜，經(jīng)PCR檢測(cè)，得到5株轉(zhuǎn)基因植株。這為以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性調(diào)節(jié)機(jī)制及通過(guò)基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；蔗糖合成酶；反義表達(dá)載體；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）04-0004-04

甜瓜（ Cucumis melo L ） 是重要的園藝植物，是世界公認(rèn)的十大健康水果之一，一直以其獨(dú)特的風(fēng)味備受青睞。甜瓜品質(zhì)主要取決于可溶性糖的種類和含量。成熟甜瓜中大于97%的可溶性固形物是可溶性糖，而蔗糖占60%左右[1]。因此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)甜瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中可溶性糖的積累

進(jìn)行了研究。張明方等[2]研究得出，在完熟的甜瓜果實(shí)中，蔗糖含量占了總糖含量的70%以上，因此蔗糖含量的多少?zèng)Q定著甜瓜質(zhì)量的優(yōu)劣； Lingle等[3]對(duì)網(wǎng)紋甜瓜果實(shí)發(fā)育的研究表明：甜瓜果實(shí)可溶性固形物的含量是衡量網(wǎng)紋甜瓜商品等級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)。目前的研究認(rèn)為甜瓜中蔗糖的含量主要取決于轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Inv）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase，SPS）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS），已經(jīng)有學(xué)者對(duì)前兩種酶在甜瓜中的具體功能進(jìn)行了研究，得出這兩種酶主要促進(jìn)蔗糖的合成[4～7]。通過(guò)查閱資料得知，SS既可以促進(jìn)蔗糖合成又可以起分解作用，但是一般認(rèn)為SS起分解蔗糖的作用。

本試驗(yàn)旨在構(gòu)建CmSS1的反義植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到甜瓜中，為進(jìn)一步研究該基因在甜瓜中的表達(dá)及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111質(zhì)粒和菌株大腸桿菌 DH5α、植物表達(dá)載體 pBI121 均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，甜瓜種子由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

112主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、 膠回收試劑盒、pMD18-T 等購(gòu)自大連寶生物公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

113培養(yǎng)基 種子生長(zhǎng)培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基；（預(yù)）共培養(yǎng)： MS+2 mg/L 6-BA；篩選培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；分化培養(yǎng)基：MS+1 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；伸長(zhǎng)培養(yǎng)基：MS+05 mg/L 6-BA+50 mg/L K +250 mg/L Cef；生根培養(yǎng)基：MS+05 mg/L IAA+25 mg/L K +125 mg/L Cef[8～10]。上述培養(yǎng)基若加入抗生素，均需將無(wú)菌的培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)上，待培養(yǎng)基冷卻至60℃后，再將無(wú)菌的抗生素加入。

12試驗(yàn)方法

121SS基因表達(dá)載體 PBI121-CmSS1 的構(gòu)建 按常規(guī)堿裂解法提取 pMD18 -T-CmSS1和pBI121 質(zhì)粒， 分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切， 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后， 用膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和 pBI121 大片段，將兩者以 1∶3 的比例混合， 用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜， 取 10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α， 將菌液均勻涂布于 LB（Kan 50 mg/L） 平板上， 37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜， 堿法提取質(zhì)粒， 經(jīng) PCR驗(yàn)證、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。

122植物材料的準(zhǔn)備選取飽滿新鮮的種子，去除堅(jiān)硬的外皮，用70%酒精處理1 min，無(wú)菌水沖洗3遍，然后用07%的NaClO浸泡15 min，用無(wú)菌水沖洗后，濾紙吸干，接種到MS固體培養(yǎng)基上，在甜瓜子葉由黃轉(zhuǎn)綠時(shí)，將子葉橫切一分為二，接種于培養(yǎng)基上，在黑暗與光照條件下預(yù)培養(yǎng)2 d，即用于轉(zhuǎn)化。

123外植體的轉(zhuǎn)化[11]①接種已經(jīng)轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單克隆，在含有Kan的YEP培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取1 ml菌液轉(zhuǎn)入10 ml不含抗生素的YEP培養(yǎng)基中進(jìn)行活化。振蕩至OD600為02～03，離心收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基懸浮稀釋10倍。

②將預(yù)培養(yǎng)后的外植體侵入農(nóng)桿菌10 min，放入到培養(yǎng)基中，在黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。

③培養(yǎng)的外植體，用滅菌水（含有Kan和頭孢霉素）洗3次，再用MS液體培養(yǎng)基洗一次，放入到分化培養(yǎng)基上，28℃下篩選培養(yǎng)。

④待芽體長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，切下芽體移入培養(yǎng)基中。等芽體長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中。待根系發(fā)育好后，揭開(kāi)組培瓶的封瓶膜，往瓶中加水以保證適當(dāng)?shù)臐穸取Ｔ谑覂?nèi)煉苗2～3 d，轉(zhuǎn)入到營(yíng)養(yǎng)缽中，在大田中進(jìn)行種植。

124PCR檢測(cè)①甜瓜幼苗總DNA提取： 取4～5葉齡的轉(zhuǎn)基因植株，按照SDS法提取總DNA。②PCR反應(yīng)：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2 1甜瓜SS基因表達(dá)載體的構(gòu)建

3小結(jié)與討論

本試驗(yàn)中采用的植物表達(dá)載體酶切后的PBI121大小為14 kb，與目的基因比較難連接，因此采用高效率的T4連接酶，同時(shí)對(duì)目的基因與植物表達(dá)載體的連接比例進(jìn)行優(yōu)化。最后得出兩者的摩爾比為1∶3時(shí)效果最佳，這與馬樂(lè)園等[12]人的研究結(jié)果相同。

在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，農(nóng)桿菌必須具有很高的活性。因此，我們?cè)谠囼?yàn)中使對(duì)數(shù)期菌液的濃度為02～03，這與陸璐等[13]的研究相同，這樣才能保持細(xì)菌的活力最高，侵染力最強(qiáng)；一旦濃度過(guò)大，超過(guò)對(duì)數(shù)期，細(xì)菌的活力就會(huì)明顯下降，侵染力降低，不利于轉(zhuǎn)化。

外植體浸泡的時(shí)間：時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起毒害作用；時(shí)間過(guò)短，轉(zhuǎn)化的頻率會(huì)降低，因此，在浸泡時(shí)，一定要選擇一個(gè)合適的浸泡時(shí)間來(lái)提高轉(zhuǎn)化效率。

反義技術(shù)在植物育種研究中有著重要應(yīng)用，根據(jù)胡蘿卜SS的cDNA在35S CaMV啟動(dòng)子調(diào)控下反義表達(dá)和轉(zhuǎn)化植株的情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株的SS活性在直根中下降，蔗糖大量積累，同時(shí)有少量葡萄糖、果糖、淀粉和纖維素積累；轉(zhuǎn)化植株的表型也有明顯變化，植株、葉和根均變小，表明SS有影響植株生長(zhǎng)的作用[14]。本試驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因植株也出現(xiàn)了植株、葉片小于對(duì)照的現(xiàn)象。對(duì)該基因的具體功能正在進(jìn)一步的驗(yàn)證當(dāng)中。

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