甜瓜蔗糖合成酶基因（CmSS1）反義表達載體的構建及遺傳

摘要：以BamH Ⅰ和Sal Ⅰ 雙酶切pMD18-T-CmSS1和表達載體pBI121，再用T4 DNA連接酶將回收的目的片段反向與pBI121連接。結果證明，CmSS1反向插入到 pBI121 中， 得到了 pBI121-CmSS1的重組質粒；利用農桿菌介導法將反義CmSS1基因轉化甜瓜，經PCR檢測，得到5株轉基因植株。這為以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性調節機制及通過基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基礎。

關鍵詞：甜瓜；蔗糖合成酶；反義表達載體；遺傳轉化

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）04-0004-04

甜瓜（ Cucumis melo L ） 是重要的園藝植物，是世界公認的十大健康水果之一，一直以其獨特的風味備受青睞。甜瓜品質主要取決于可溶性糖的種類和含量。成熟甜瓜中大于97%的可溶性固形物是可溶性糖，而蔗糖占60%左右[1]。因此，國內外許多學者對甜瓜果實發育過程中可溶性糖的積累

進行了研究。張明方等[2]研究得出，在完熟的甜瓜果實中，蔗糖含量占了總糖含量的70%以上，因此蔗糖含量的多少決定著甜瓜質量的優劣； Lingle等[3]對網紋甜瓜果實發育的研究表明：甜瓜果實可溶性固形物的含量是衡量網紋甜瓜商品等級的重要標準。目前的研究認為甜瓜中蔗糖的含量主要取決于轉化酶（Invertase，Inv）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase，SPS）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS），已經有學者對前兩種酶在甜瓜中的具體功能進行了研究，得出這兩種酶主要促進蔗糖的合成[4～7]。通過查閱資料得知，SS既可以促進蔗糖合成又可以起分解作用，但是一般認為SS起分解蔗糖的作用。

本試驗旨在構建CmSS1的反義植物表達載體，并通過農桿菌介導法轉化到甜瓜中，為進一步研究該基因在甜瓜中的表達及生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

11試驗材料

111質粒和菌株大腸桿菌 DH5α、植物表達載體 pBI121 均為山東農業大學園藝學院實驗室保存，甜瓜種子由山東農業大學園藝學院實驗室提供。

112主要試劑限制性內切酶、T4連接酶、 膠回收試劑盒、pMD18-T 等購自大連寶生物公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其他試劑為國產分析純。

113培養基 種子生長培養基：MS固體培養基；（預）共培養： MS+2 mg/L 6-BA；篩選培養基：MS+2 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；分化培養基：MS+1 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；伸長培養基：MS+05 mg/L 6-BA+50 mg/L K +250 mg/L Cef；生根培養基：MS+05 mg/L IAA+25 mg/L K +125 mg/L Cef[8～10]。上述培養基若加入抗生素，均需將無菌的培養基置于超凈工作臺上，待培養基冷卻至60℃后，再將無菌的抗生素加入。

12試驗方法

121SS基因表達載體 PBI121-CmSS1 的構建 按常規堿裂解法提取 pMD18 -T-CmSS1和pBI121 質粒， 分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切， 酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后， 用膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和 pBI121 大片段，將兩者以 1∶3 的比例混合， 用T4 DNA連接酶16℃連接過夜， 取 10 μl連接產物轉化大腸桿菌DH5α， 將菌液均勻涂布于 LB（Kan 50 mg/L） 平板上， 37℃倒置培養過夜， 堿法提取質粒， 經 PCR驗證、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切驗證陽性克隆。

122植物材料的準備選取飽滿新鮮的種子，去除堅硬的外皮，用70%酒精處理1 min，無菌水沖洗3遍，然后用07%的NaClO浸泡15 min，用無菌水沖洗后，濾紙吸干，接種到MS固體培養基上，在甜瓜子葉由黃轉綠時，將子葉橫切一分為二，接種于培養基上，在黑暗與光照條件下預培養2 d，即用于轉化。

123外植體的轉化[11]①接種已經轉入植物表達載體的農桿菌單克隆，在含有Kan的YEP培養基振蕩培養過夜，取1 ml菌液轉入10 ml不含抗生素的YEP培養基中進行活化。振蕩至OD600為02～03，離心收集菌體，用MS液體培養基懸浮稀釋10倍。

②將預培養后的外植體侵入農桿菌10 min，放入到培養基中，在黑暗條件下共培養3 d。

③培養的外植體，用滅菌水（含有Kan和頭孢霉素）洗3次，再用MS液體培養基洗一次，放入到分化培養基上，28℃下篩選培養。

④待芽體長至1 cm左右時，切下芽體移入培養基中。等芽體長至2～3 cm時，轉入到生根培養基中。待根系發育好后，揭開組培瓶的封瓶膜，往瓶中加水以保證適當的濕度。在室內煉苗2～3 d，轉入到營養缽中，在大田中進行種植。

124PCR檢測①甜瓜幼苗總DNA提取： 取4～5葉齡的轉基因植株，按照SDS法提取總DNA。②PCR反應：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35個循環；延伸72℃ 10 min。反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2 1甜瓜SS基因表達載體的構建

3小結與討論

本試驗中采用的植物表達載體酶切后的PBI121大小為14 kb，與目的基因比較難連接，因此采用高效率的T4連接酶，同時對目的基因與植物表達載體的連接比例進行優化。最后得出兩者的摩爾比為1∶3時效果最佳，這與馬樂園等[12]人的研究結果相同。

在轉化過程中，農桿菌必須具有很高的活性。因此，我們在試驗中使對數期菌液的濃度為02～03，這與陸璐等[13]的研究相同，這樣才能保持細菌的活力最高，侵染力最強；一旦濃度過大，超過對數期，細菌的活力就會明顯下降，侵染力降低，不利于轉化。

外植體浸泡的時間：時間過長，會引起毒害作用；時間過短，轉化的頻率會降低，因此，在浸泡時，一定要選擇一個合適的浸泡時間來提高轉化效率。

反義技術在植物育種研究中有著重要應用，根據胡蘿卜SS的cDNA在35S CaMV啟動子調控下反義表達和轉化植株的情況，發現轉化植株的SS活性在直根中下降，蔗糖大量積累，同時有少量葡萄糖、果糖、淀粉和纖維素積累；轉化植株的表型也有明顯變化，植株、葉和根均變小，表明SS有影響植株生長的作用[14]。本試驗中的轉基因植株也出現了植株、葉片小于對照的現象。對該基因的具體功能正在進一步的驗證當中。

參考文獻：

[1]王堅中國西瓜甜瓜[M]北京：中國農業出版社，2000，435-436

[2]張明方， 李志凌， 陳昆松， 等網紋甜瓜發育果實糖積累與蔗糖代謝參與酶的關系[J]植物生理與分子生物學學報， 2003， 29（5）：455-462

[3]Lingle S E， Dunlap J R Sucrose metabolism in netted muskmelon fruit during development[J]Plant Physiol， 1987，84（2）：386-389

[4]Yu Xiyan ，Wang Xiufeng ，Zheng Chengchao Antisense suppression of an acid invertase gene in muskmelon alters plant growth and fruit development [J]JExpBot，2008，59（11）：2955-2967

[5]Yu Xiyan，Fan Jide，Kong Qingguo，et al Antisense acid invertase （MAI1） gene alters soluble sugar composition and size in transgenic muskmelon fruit [J] Acta Hort，2007， 763：237-243

[6]樊繼德 甜瓜反義酸性轉化酶基因表達特性分析及功能鑒定[D]泰安：山東農業大學，2007

[7]田紅梅甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因的功能鑒定與分析[D]泰安：山東農業大學，2011

[8]王建設， 陳杭 甜瓜再生芽高效誘導方法的研究[J]園藝學報， 2000， 26（5）：339-340

[9]于喜艷， 何啟偉， 孔慶國 甜瓜子葉組織培養的研究[J]山東農業科學， 2002，2：22-23

[10]夏海武， 馬秀蘭， 萬永霞甜瓜組織培養與快速繁殖的研究[J]山東農業科學， 2005，2：23-24

[11]王慧中， 李亞南， 趙培潔 根癌農桿菌介導的甜瓜基因轉化及其轉基因植株的再生[J]浙江大學學報（農業與生命科學版）， 2000， 26（3）： 287- 290

[12]馬樂園，于喜艷 甜瓜果實八氫番茄紅素合成酶基因的克隆及正義表達載體的構建[J] 山東農業科學，2011，8：4-7

[13]陸璐， 趙長曾， 陸婷 甜瓜“黃旦子”子葉再生完整植株的研究[J]西北農林科技大學學報（自然科學版）， 2005， 33（8）：81-85

[14]Tang G Q，Sturm AAntisense repression of sucrose synthase in carrot（Daucus carota L）affects growth rather than sucrose partitioning[J]Plant MolBiol，1999，41（4）：465-479