牛病毒性腹瀉病毒山東株的分離與鑒定

摘要：牛病毒性腹瀉病毒是牛病毒性腹瀉-黏膜病的重要病原體，該病毒病是極為復雜、呈多臨床類型表現的傳染病，給世界養牛業造成了巨大的經濟損失。本研究從疑似牛病毒性腹瀉-黏膜病的糞便中分離得到一株病毒能使MDBK細胞產生細胞病變，經RT-PCR檢測及擴增產物測序進一步證實，該病毒為牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒，TCID50測定該病毒的滴度為107.15TCID50/ml。該病毒株的分離鑒定為牛病毒性腹瀉病毒疫苗的研制奠定了基礎。

關鍵詞：牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒；分離；鑒定

中圖分類號：S852.65+3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0041-04

牛病毒性腹瀉-黏膜病 （Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease，BVD-MD） 是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV）感染而引起的一種重要傳染病，臨床上以發熱、腹瀉、黏膜糜爛、潰瘍、白細胞減少、持續感染與免疫耐受、免疫抑制、懷孕母牛流產、產死胎和畸型胎以及致死性黏膜病為主要特征[1，2]。該病呈世界性分布，廣泛存在于美國、澳大利亞、英國、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等國家[3]。BVDV不僅可感染牛，也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其它反芻動物。1946年美國人Olafson等首次發現并分離出BVDV，1983年我國李佑民等首次從流產胎兒的脾臟中分離到BVDV。BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae），瘟病毒屬（Pestivirus），與豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）和綿羊邊界病毒（Border Disease Virus，BDV） 同屬，存在抗原相關性，在血清學上存在著交叉反應，而且能夠突破宿主特異性發生交叉感染[4]。根據BVDV病毒基因組5′端非翻譯區（5′NTR）序列比較，把BVDV分為牛病毒性腹瀉病毒Ⅰ型（BVDV-Ⅰ）和牛病毒性腹瀉病毒Ⅱ型（BVDV-Ⅱ）[5，6]。根據BVDV可否使體外培養的傳代上皮細胞發生病變效應，可分為兩個生物型（biotype）：致細胞病變型（cytopathic，CP）和非致細胞病變型（noncytopathic，NCP）[7]。兩種生物型的病毒雖然與宿主細胞的作用不同，但BVDV只有一種血清型。BVDV感染情況復雜，持續性感染個體癥狀隱蔽。動物帶毒率高，特別是BVDV嚴重影響感染動物的繁殖，因此給全球畜牧業造成了巨大的經濟損失[8]。因而被世界動物衛生組織（OIE）列為發病必須上報的動物傳染病之一。本研究采集山東省某牛場發生嚴重腹瀉癥狀的病牛的糞便，并對其進行了分離和鑒定，BVDV山東株的獲得為BVDV疫苗的研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

牛腎細胞（MDBK ）由山東省農業科學院奶牛研究中心實驗室保存；DNA Marker DL2000 購于上海生工生物工程技術服務有限公司；DMEM細胞培養基、新生馬血清、胰蛋白酶為HyClone公司生產；MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，TaKaRa pimeScriptTM RT-PCR Kit，LA Taq酶，dNTP， RNA酶抑制劑，均購于寶生物工程（大連） 有限公司。病料樣品為山東省某牛場發生嚴重腹瀉癥狀的病牛的糞便。

1.2病毒培養

1.2.1病料的處理取腹瀉奶牛糞便，用PBS（含10% 雙抗） 1∶5 稀釋。3 000 r/min 離心10 min，得到的上清液經0.22 μm 濾膜過濾除菌后得到病料處理液。

1.2.2病毒的接種選擇生長旺盛的MDBK單層細胞，棄去營養液。按細胞培養瓶1%的量接種病料處理液后37℃感作1 h，棄去感作液，加入維持液（2%新生馬血清的DMEM）于5%CO2、37℃培養。12 h觀察細胞病變，培養24 h后收毒。細胞毒反復凍融3次后再次接種MDBK 細胞，如此傳3代，收獲的細胞毒用于其它試驗。

1.3RT-PCR 鑒定及序列測定分析

1.3.1引物的設計合成根據已發表的BVDV NADL 株、Osloss 株、Orengon C24 等毒株的全序列的5′UTR保守區設計BVDV檢測引物及分型引物[9，10]，引物序列信息見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。