蓖麻籽蛋白質(zhì)的粗分離

摘要：以蓖麻籽中總蛋白為研究對象，對磷酸鹽法提取蓖麻籽中粗蛋白過程進行優(yōu)化。結(jié)果表明，在硫酸氨飽和度為70%時對蓖麻籽中粗蛋白的提取效率最高；利用優(yōu)化后的磷酸鹽法對7個不同發(fā)育時期的蓖麻籽中的蛋白質(zhì)進行粗提取，并利用紫外分析法對所提取的不同生長階段的蓖麻籽中的粗蛋白進行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自植株授粉后到獲取蓖麻籽的時間間隔越長蓖麻籽中總蛋白積累量就越高。

關(guān)鍵詞：蓖麻籽；蛋白質(zhì)；提取

中圖分類號：S565.601文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0110-03

蛋白質(zhì)的提取方法有很多，目前文獻已報道過的蛋白質(zhì)提取方法主要有水溶液提取法、有機溶劑提取法以及酶法和超聲波萃取法等[1～5]。蓖麻（Ricinus communis）在國內(nèi)種植廣泛，資源豐富。為進一步加深對蓖麻籽中酶的研究和利用，本實驗利用磷酸緩沖液（PB）法提取蓖麻籽蛋白質(zhì)，并對鹽析濃度進行優(yōu)化，同時利用優(yōu)化后的提取方法對在不同發(fā)育時期的蓖麻籽粗蛋白進行提取并比較分析。

1材料與方法

1.1材料

成熟通蓖五號種子，通遼巨大種業(yè)公司提供。

種植在實驗田的哲蓖四號經(jīng)人工授粉后采集分期蓖麻種子，授粉當天為0 DAP（Days after pollination），授粉第二天為1 DAP；分別采集哲蓖四號同一植株上16、23、30、37、44、51、69 DAP共7個不同時期的種子，采集后立即去殼并放入超低溫冰箱中。

1.2主要儀器

高速冷凍離心機，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；精密pH計，上海精密科學儀器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-B數(shù)顯恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3蓖麻籽粗蛋白提取方法的優(yōu)化

參照曾佑煒等[6]的方法并稍作修改。

從超低溫冰箱中取出去殼的通蓖五號蓖麻籽適量，放入冷凍好的研缽中迅速研磨。充分研磨后稱取8.0 g放入50 ml的離心管中，加入5 mmol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 6.5，含100 mmol/L NaCl，緩沖液A）32 ml，并充分混勻，4℃放置過夜。4℃、14 000 r/min離心30 min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清于另一離心管中，相同條件下重復離心1次。取7個1.5 ml的離心管，將所得上清液各取1 000 μl，分別加入不同質(zhì)量的固體硫酸銨，使各管的硫酸銨濃度依次為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃放置過夜。4℃、17 000 r/min離心30 min，棄去上清，取500 μl緩沖液A將沉淀溶解。

1.4粗蛋白的電泳檢測

將得到的蓖麻粗蛋白提取物進行SDS-PAGE檢測。濃縮膠的濃度為5%，分離膠濃度為12%。分別將上述所得的蓖麻粗蛋白提取液取樣100 μl，加入25 μl的5×蛋白緩沖液混勻，沸水中煮沸5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清25 μl點樣，電泳，經(jīng)染色及脫色后觀察。

1.5粗蛋白含量的測定

利用紫外分光光度計對蓖麻籽中的蛋白含量進行測定。將各管提取樣液20倍稀釋后，在280 nm和260 nm處分別測出其吸光值（A值），然后利用280 nm及260 nm下的吸收差來求出蛋白質(zhì)的濃度[7]。

蛋白質(zhì)的濃度 （mg/ml） =1.45A280-0.74A260

1.6利用優(yōu)化后方案提取哲蓖四號蓖麻籽粗蛋白并檢測

分別將采集的不同發(fā)育時期蓖麻種子經(jīng)充分研磨后，稱取0.25 g樣品放入1.5 ml離心管中，依據(jù)料液比為1∶4的比例，每管分別加入1 000 μl的緩沖液A。依據(jù)上述粗蛋白提取方法提取粗蛋白并溶解于500 μl緩沖液A中，利用紫外分光光度法測定粗蛋白含量，同時進行SDS-PAGE電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1蓖麻籽中總蛋白粗提優(yōu)化體系的確定

2.1.1紫外法檢測分析所提通蓖5號蓖麻籽中粗蛋白含量的結(jié)果由圖1可以明顯看出，在硫酸銨飽和度為70%時對蓖麻籽中蛋白質(zhì)的粗提效果最佳；粗蛋白提取量在硫酸銨飽和度為40%～50%之間的增率最大，而其他各梯度之間的差率跨度并不是太大。