日本三角渦蟲(chóng)全能干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

摘要：渦蟲(chóng)具有極強(qiáng)的再生能力，并且認(rèn)為渦蟲(chóng)體內(nèi)存在一類(lèi)具有增殖分化潛能被稱(chēng)為neoblasts的全能干細(xì)胞。這種細(xì)胞在渦蟲(chóng)體內(nèi)可發(fā)生遷移、增殖和分化，對(duì)其個(gè)體組織器官損傷的修復(fù)具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，三角渦蟲(chóng)經(jīng)過(guò)饑餓處理后切取特定的組織塊，然后再經(jīng)過(guò)處理使組織塊中的細(xì)胞分離出來(lái)。分離的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并通過(guò)堿性磷酸酶檢測(cè)最終鑒定為neoblasts干細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：三角渦蟲(chóng)；全能干細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：Q959.151+.302文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0034-04

渦蟲(chóng)（Planarian）是動(dòng)物界最早出現(xiàn)兩側(cè)對(duì)稱(chēng)、三胚層、營(yíng)自由生活的扁形動(dòng)物，也是由水生向陸生過(guò)渡的重要類(lèi)群，因而在動(dòng)物系統(tǒng)演化中占有重要地位[1]。渦蟲(chóng)國(guó)內(nèi)分布廣泛，進(jìn)化地位十分重要，是發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和再生生物學(xué)、進(jìn)化和遺傳學(xué)研究的好材料。Kawakatsu認(rèn)為中國(guó)的淡水三角渦蟲(chóng)全部屬于三角渦蟲(chóng)屬中的日本三角渦蟲(chóng)（Dugesia japonica Ichikawa et Kawakatsu）[2]。不同的地區(qū)和環(huán)境對(duì)其生殖具有一定影響，但大多以有性和無(wú)性方式交替進(jìn)行。渦蟲(chóng)具有極強(qiáng)的再生能力，已知如果把渦蟲(chóng)切割成許多小的片段，一周內(nèi)它可以重新長(zhǎng)成完整的個(gè)體[3，4]。其再生潛能歸因于體內(nèi)一類(lèi)稱(chēng)為“neoblasts”的細(xì)胞群，這是成體渦蟲(chóng)體內(nèi)僅有的一類(lèi)具有增殖分化潛能的干細(xì)胞，即成體未分化細(xì)胞[5～7]。它在整個(gè)個(gè)體的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)都有分布，而在其它類(lèi)型細(xì)胞如上皮細(xì)胞、腸細(xì)胞、腦部分布較少；在生長(zhǎng)、喂養(yǎng)、饑餓狀態(tài)下細(xì)胞狀態(tài)也處于動(dòng)態(tài)的變化[8～9]。其體內(nèi)neoblasts約占全部細(xì)胞的30%，是一種全能干細(xì)胞，可分化為體內(nèi)的40多種細(xì)胞，因此成為研究胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化與去分化分子機(jī)理的理想材料[10]。

迄今為止，體外分離干細(xì)胞技術(shù)已有很多報(bào)道，建立在對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的識(shí)別基礎(chǔ)上用來(lái)純化干細(xì)胞的標(biāo)記包括CD34、AC133、STRO-1、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體p7520等[11]。分離方法包括熒光標(biāo)記細(xì)胞分選、免疫磁分離和免疫吸附柱分離；密度梯度離心法從單個(gè)核細(xì)胞中分離干細(xì)胞也用于渦蟲(chóng)干細(xì)胞的分離[12～13]，但這種方法要求的實(shí)驗(yàn)器材與熟練程度都比較高且操作繁瑣，因此不常用。常用的分離哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的方法是通過(guò)胰酶處理組織塊，使之消化成單個(gè)細(xì)胞，再用培養(yǎng)液培養(yǎng)，但處理時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的損傷。在現(xiàn)代再生科學(xué)方面，最早嘗試培養(yǎng)渦蟲(chóng)細(xì)胞是在芝加哥Ch.M.Child’s實(shí)驗(yàn)室[14]。但是直到目前，沒(méi)有任何關(guān)于穩(wěn)定培養(yǎng)扁形動(dòng)物細(xì)胞系的報(bào)道。最近有neoblasts細(xì)胞重要性及其分子相關(guān)實(shí)驗(yàn)方面的報(bào)道，所以在借鑒國(guó)外分離日本三角渦蟲(chóng)全能干細(xì)胞neoblasts方法的基礎(chǔ)上，摸索建立穩(wěn)定的neoblasts細(xì)胞系非常重要[15～17]。

干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有較高的堿性磷酸酶（ALP），而已分化的細(xì)胞中活性明顯降低。在堿性磷酸酯酶的催化下，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸（BCIP）會(huì)被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會(huì)和氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的NBT-formazan產(chǎn)物，所以利用這一點(diǎn)可以鑒定細(xì)胞是否為干細(xì)胞[18～19]。本實(shí)驗(yàn)初步摸索了一種分離培養(yǎng)及鑒定渦蟲(chóng)全能干細(xì)胞neoblasts的方法，為下一步開(kāi)展渦蟲(chóng)相關(guān)方面的研究提供了一定的基礎(chǔ)。