花生蛋白激酶基因AhSTK的克隆與序列分析

摘要：從優質花生魯花14的cDNA文庫中發現一條序列，全長為1 399 bp，3′端含有polyA尾，通過blastx搜索得知其為蛋白激酶基因，命名為AhSTK。以該花生cDNA序列為模板設計引物，克隆得到花生AhSTK基因。序列分析表明，AhSTK基因的開放閱讀框長度為1 080 bp，編碼359個氨基酸，預測其分子量為389 kD，等電點為642，編碼的蛋白質無信號肽，無跨膜結構，預測定位于細胞質。與其他植物中蛋白激酶的氨基酸序列比對發現，與大豆GmSTK蛋白同源性最高。器官特異性分析發現，該基因在花生根中表達量較高，而在花中表達量較低。花生AhSTK基因的克隆為進一步研究其生物學功能和應用奠定了基礎。

關鍵詞：花生；蛋白激酶；AhSTK蛋白；序列分析；器官特異性表達

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0009-05

蛋白激酶是一類磷酸轉移酶，在真核生物中其作用是將ATP的γ磷酸基團轉移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質磷酸化。目前在很多植物中發現并分離出了蛋白激酶，如擬南芥[1]、玉米[2]、小麥[3]、豌豆[4]、煙草[5]、紫花苜蓿[6]、大豆[7]、番茄[8]、水稻[9]等，這些蛋白激酶的磷酸化過程被證實參與植物中的許多信號途徑，包括抵抗高鹽、干旱和低溫等惡劣條件的反應，調節植物組織、器官的正常發育，保持植物正常生理功能，參與激素信號傳遞等。

Stone和Walker根據蛋白激酶催化區域氨基酸序列的相似性，將植物蛋白激酶分為5大組，分別為①AGC組：以cAMP（環腺苷酸）依賴的蛋白激酶PKA、cGMP（環鳥苷酸）依賴的蛋白酶PKG及鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC為代表，以受第二信使（如cAMP、cGMP、DAG和Ca2+）激活為特征；②CaMK組：包括Ca2+/CaM依賴的蛋白激酶CaMK、Ca2+依賴而CaM不依賴的蛋白激酶CDPK等，依賴第二信使是該組蛋白激酶的普遍性；③CMGC組：包括MAPK（分裂原激活的蛋白激酶）、CDK（周期素依賴的蛋白激酶）等，相對于前2組蛋白激酶依賴于第二信使，該組激酶作用于下游的磷酸化級聯系統；④傳統的PTK組：為酪氨酸蛋白激酶，目前在植物中尚未發現純粹的酪氨酸蛋白激酶，但并不意味著Tyr殘基的磷酸化對植物不重要。二重特異性蛋白激酶如MAPKK在植物中的發現，證明了Tyr殘基的磷酸化可能在高等植物中具有重要的生理作用；⑤其它組：如類受體蛋白激酶RLKs及乙烯信號轉導元件CTRl（胞質級聯蛋白激酶MAPKKK）等[10]。一般由蛋白激酶催化的磷酸化反應中接受磷酸基的部位是絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的羥基。蛋白激酶在信號轉導中主要有兩個方面的作用：一是通過磷酸化調節蛋白質活性，磷酸化和去磷酸化是大多數信號通路組分可逆激活的共同機制，一些蛋白質磷酸化后具有活性，一些則去磷酸化后具有活性；二是通過蛋白質的逐級磷酸化，使信號逐級放大，引起細胞反應[11]。

對植物蛋白激酶的研究開始較晚，主要集中在對受體蛋白激酶的研究上，其他類蛋白激酶的研究還處于初級階段。隨著在越來越多植物中發現蛋白激酶，它在植物生長發育、抗逆性、激素及鈣信號傳導等的作用研究也越來越深入。這為了解植物生長發育及抗逆性機制，改良植物尤其是農作物表觀性狀或抗逆性等方面提供了必要的條件[12]。

花生是我國重要的油料和經濟作物之一，種植面積約5025×104 hm2，總產量居世界首位[13]。花生在其生長過程中經常會遭受不同的生物和非生物脅迫，嚴重影響植物的生長發育，并對農業生產造成極大的負面影響[14]。通過對花生AhSTK基因及其編碼蛋白的分析與研究，可以了解其參與的信號途徑及其生理功能，為增強花生抗逆性、調節花生生長發育及提高花生產量提供一定的理論基礎。

本試驗從優質花生魯花14 cDNA文庫中獲得了AhSTK基因， 利用PCR方法獲得AhSTK基因目的片段，對其進行生物信息學分析，為今后的轉基因工作奠定基礎。1材料與方法

11試驗材料

111植物材料試驗材料為優質花生品種魯花14，種植于山東省農業科學院實驗農場。

112試驗試劑RNA 的CTAB 提取液由本實驗室配制，參照《分子克隆實驗指南》（Sambrook and Russell， 2002）；DNA回收試劑盒（TIANGEN），反轉錄試劑盒（Fermentas），rTaq酶（Takara），T4 DNA Ligase（Takara），其他常規化學試劑均為國產分析純。

113載體及菌株T3克隆載體、大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α均購于全式金。

114引物的合成目的基因的克隆引物和花生內參基因Actin的克隆引物（上海生工公司合成）。

12試驗方法

121AhSTK基因序列的獲得通過對花生EST序列（EG0288151、ES7036391、ES7037731、ES7229771、GO3267121、GO3322971）進行電子拼接得到AhSTK基因序列。

122花生總RNA的提取、純化及反轉錄取適量花生根、莖、葉、幼嫩種子、花加入液氮研磨，用CTAB法提取總RNA。按照Fermentas公司的反轉錄試劑盒操作步驟進行反轉錄，得到完整的cDNA。所有cDNA樣品均保存于-20℃冰箱中備用。

123目的基因的獲得與克隆以該序列為模板，利用上游引物AhSTK-S和下游引物AhSTK-A克隆該基因。 PCR擴增反應程序為： 94℃預變性5 min；94℃變性30 s， 55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將與目的基因大小一致的PCR產物回收，回收的目的片段連入T3克隆載體測序。

124質粒的提取、DNA片段的回收 分別采用TIANGEN公司的普通質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行。

125目的基因序列分析目的基因序列采用NCBI數據庫ORF Finder（http：//wwwncbinlm

nihgov/gorf/gorfhtml） 在線分析獲得開放閱讀框，使用Primer50翻譯獲得氨基酸序列，登陸網站http：//webexpasyorg/protparam/推測目的蛋白的分子質量和等電點，信號肽、跨膜區的預測分別通過網站http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/ 和http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/獲得，從http：//wwwncbinlmnihgov/Structure/cdd/wrpsbcgi網站獲得AhSTK蛋白的保守結構域，亞細胞定位預測分析在http：//wwwbioinfotsinghuaeducn/SubLoc/上進行。將預測的AhSTK蛋白序列與GenBank中其他植物的AhSTK蛋白通過DNAMAN進行序列比對，構建系統進化樹。

126器官特異性表達分析內參基因Actin的擴增：以反轉錄產物cDNA為模板，利用上游引物Actin-S和下游引物Actin-A克隆Actin基因。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，28個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物用15%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過調整各模板量，使不同樣品擴增的Actin的量一致。

AhSTK基因的擴增：以摸索好的cDNA模板量和循環數、最佳擴增條件來擴增單一的目的條帶。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，32個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

21AhSTK基因序列的克隆

在對花生cDNA文庫進行大規模測序獲得的序列中，我們發現一條編碼一種蛋白激酶的序列。在NCBI中進行Blast比對，找到6條同源性較高的EST序列（EG0288151、ES7036391、ES7037731、ES7229771、GO3267121、GO3322971）。通過電子拼接，可以把這7條EST序列拼接為一條具有完整讀碼框的花生蛋白激酶基因序列。該序列全長1 399 bp，5′UTR 為52 bp，3′UTR為267 bp，讀碼框1 080 bp（圖1）。

22AhSTK基因序列分析

通過NCBI中的ORF Finder分析知，AhSTK基因具有完整的開放閱讀框（ORF），在擴增片段的36 bp處有起始密碼子ATG，在1 113 bp處有終止密碼子TAA（見圖1），因此該基因編碼的蛋白質有359個氨基酸，其相對分子量約為389 kD，等電點為642。

通過NCBI軟件分析該蛋白的保守結構域，發現從70到265氨基酸之間含有以cAMP（環腺苷酸）依賴的蛋白激酶PKA的保守催化結構域（圖3），催化ATP的γ磷酸基團轉移到底物特定的絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸的羥基上，使蛋白質磷酸化，引起下一個激酶的反應，以此使信號從細胞表面傳遞到靶蛋白，引起細胞反應。

根據http：//prositeexpasyorg/分析保守結構域，67到347氨基酸之間是蛋白激酶的結構域，從81處的纈氨酸到96處的賴氨酸之間是ATP結合域，193處的異亮氨酸到205處的異亮氨酸之間是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性域。

根據以上分析推測，AhSTK基因編碼的蛋白催化ATP的γ磷酸基團轉移到底物特定的絲氨酸/蘇氨酸羥基上，屬于PKA。如多數蛋白激酶一樣，此類蛋白激酶自身受到嚴格的調節，當cAMP不存在時呈非活性形式，與其它蛋白激酶不同的是，活化配體cAMP結合到特異的調節亞基（R）上引起構型的改變從而導致全酶的解離，經活化而解離的催化亞基（C）和所有真核生物的蛋白激酶有著廣泛相似的結構序列。

23AhSTK蛋白的信號肽與亞細胞定位分析

經過SignalP40軟件分析，發現AhSTK蛋白沒有信號肽；用TMHMM20分析得知，該蛋白不含跨膜結構域；亞細胞定位分析顯示該蛋白位于細胞質。

24AhSTK蛋白的系統進化樹分析

利用DNAMAN軟件將該基因氨基酸序列與其他六種植物氨基酸序列進行比對，發現有很高的同源性，其中與大豆中的GmSTK蛋白同源性最高，其次是苜蓿（圖4）。

25AhSTK的器官特異性表達分析

我們進一步分析了AhSTK基因在花生不同器官的表達情況，結果（圖5）表明，AhSTK基因在根中表達量最高，在幼嫩種子中次之，花中表達量最低。

本研究從花生中克隆并鑒定了AhSTK基因。用NCBI中的ORF Finder找出該基因具有完整的開放ORF，編碼359個氨基酸，從70到265氨基酸之間含有蛋白激酶保守的催化結構域，從81處的纈氨酸到96處的賴氨酸之間是ATP結合域，193處的異亮氨酸到205處的異亮氨酸之間是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性域，屬于cAMP（環腺苷酸）依賴的蛋白激酶PKA。同源性比對發現與其他植物中的蛋白激酶有很高的同源性，挑選相似性較高的序列進行多序列比對，發現這些蛋白在蛋白激酶保守結構域處序列非常相似；系統進化分析得知花生AhSTK蛋白與大豆GmSTK親緣關系較近，其次是苜蓿。亞細胞定位預測顯示其定位在細胞質；半定量分析得出其在根中表達量最高。這類蛋白在植物中調節離子通道活性的功能研究得較清楚，但其參與調節基因的表達及響應外界高鹽、干旱等刺激還有待進一步研究。本實驗只對花生中AhSTK基因及其蛋白序列做了克隆與分析，對其功能的研究還需進一步探索。參考文獻：

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