花生赤霉素2—氧化酶基因的克隆和表達(dá)研究

摘要：赤霉素2-氧化酶（GA2ox）是赤霉素合成過程中起負(fù)調(diào)控作用的一種關(guān)鍵酶，催化有活性的赤霉素生成無活性的赤霉素。從花生莢果發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組序列中篩選到GA2ox的基因片段，采用5′-RACE方法克隆了花生GA2ox基因的全長cDNA序列。序列分析表明，花生GA2ox蛋白氨基酸序列含有和其他植物同樣保守的結(jié)構(gòu)域。通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)GA2ox基因在花生不同組織器官中的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的10種組織中均有GA2ox的表達(dá)，其中成年葉片中表達(dá)最豐富，根、剛?cè)胪恋墓槾沃１狙芯拷Y(jié)果為進(jìn)一步分析該基因在花生生長發(fā)育過程中的作用提供了有用信息。

關(guān)鍵詞：花生；赤霉素；赤霉素2-氧化酶；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0014-05

赤霉素（gibberellins， GAs）是一類四環(huán)雙萜類的植物激素，具有生物活性的赤霉素在高等植物種子萌發(fā)、莖伸長、開花誘導(dǎo)及種子和果實(shí)的生長等過程中起著重要作用。植物也可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源赤霉素的生物合成介導(dǎo)自身對(duì)環(huán)境因子的應(yīng)答[1，2]。自1935年首次成功分離出赤霉素以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一百多種赤霉素分子，但僅有GA1，GA3和GA4等少數(shù)具有生物學(xué)活性[3，4]。

多種酶參與植物體內(nèi)赤霉素的生物合成，GA2-氧化酶（gibberellin 2-oxidase， GA2ox）是在赤霉素合成途徑中起負(fù)調(diào)控作用的一種關(guān)鍵酶，GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4，使兩者在C-2位羥基化轉(zhuǎn)變成無活性的GA8和GA34[5]。在植物中豌豆的GA2ox （SLN）最早被克隆，其編碼蛋白能催化GA1、GA4和GA20生產(chǎn)相應(yīng)的2β羥基化產(chǎn)物，它一般在花、根和種皮中表達(dá)[6，7]。目前，多種高等植物的GA2ox基因已經(jīng)被克隆和研究，結(jié)果表明GA2ox基因一般以基因家族的形式出現(xiàn)。GA2ox家族可以分為3類，第一類和第二類作用于C19-GAs（GA1和GA4），使之失活，或使其前體（GA9和GA20）失活；第三類作用于C20-GAs，使之2β-羥基化，這類基因包括（AtGA2ox7-8和SoGA2ox3）。后來的研究發(fā)現(xiàn)菠菜的GA2ox1可以同時(shí)作用于C19-GAs和C20-GAs[9]。這些研究結(jié)果表明植物中存在兩種具有不同特異性的GA2-氧化酶。

GA2ox催化GAs進(jìn)行羥基化反應(yīng)使植物體內(nèi)GA含量降低。在煙草中過量表達(dá)AtGA2ox7-8會(huì)使赤霉素含量降低，產(chǎn)生矮化表型[8]。在擬南芥中過量表達(dá)GA2ox可以使植株出現(xiàn)矮化，而且使開花時(shí)間延長，影響種子的育性等[10～12]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RACE技術(shù)首次從花生中克隆得到AhGA2ox基因，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)該基因在花生不同組織器官中的表達(dá)進(jìn)行研究，為今后研究花生莢果發(fā)育過程中赤霉素合成調(diào)控以及赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)的作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

以魯花14花生品種為材料，大田栽種，日常管理，收集不同發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉、花、果針、莢果和種子，用于RNA提取。

12試驗(yàn)方法

121cDNA 合成與高通量測(cè)序提取不同發(fā)育時(shí)期花生莢果的總RNA，用Agilent 2100檢測(cè)提取RNA樣品的質(zhì)量與純度，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。將來自于入土生長0、3、10天的花生果針mRNA等量混合，加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短片段（ 200～700 nt ），以mRNA為模板，用隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H（Invitrogen）和DNA 聚合酶 Ⅰ（New England Biolabs）合成cDNA第二鏈，經(jīng)純化后做末端修復(fù)，加poly（A）并連接測(cè)序接頭，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序。

122數(shù)據(jù)分析得到測(cè)序結(jié)果后，將原始數(shù)據(jù)去除接頭得到clean reads，用SOAPdenovo軟件將clean reads進(jìn)行無參考基因組拼接，最終得到unigenes。對(duì)得到的unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastX （E value <10-5）比對(duì)分析，并根據(jù)注釋結(jié)果和ESTScan軟件分析結(jié)果完成對(duì)序列的功能注釋。

123AhGA2ox基因克隆提取魯花14果針的RNA，利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到花生果針cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的GA2ox基因片段，設(shè)計(jì)5′-RACE引物：outer：GGTGGCACTGAAACCCAAC

TCCTATCTC；inner：GGAGGGTAATGGTTGAGCCTGAAGACTG。

以cDNA為模板進(jìn)行RACE擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋旱谝惠啠?4℃ 30 s，72℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

分析測(cè)序結(jié)果后設(shè)計(jì)克隆AhGA2ox全長引物：AhGA2oxF： CTTGTGTGTG TTCTAACTTCCA，AhGA2oxR： CCTATGACGCCACGACTT，以花生cDNA為模板擴(kuò)增AhGA2ox基因全長。

124AhGA2ox基因序列分析利用Premier 50設(shè)計(jì)PCR引物。AhGA2ox基因的同源性分析使用NCBI的在線分析工具Blastn和Blastp；Expert Protein Analysis System在線服務(wù)用于分析AhGA2ox基因的編碼蛋白；使用在線軟件ProtScale（http：//usexpasyorg/cgi-bin/protscalepl）對(duì)AhGA2ox蛋白的疏水性進(jìn)行分析； 用TMHMM和SignalP分別對(duì)AhGA2ox跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用CluscalW和MEGA50進(jìn)行AhGA2ox基因的多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹。

125qRT-PCR分析qRT-PCR反應(yīng)以花生不同發(fā)育時(shí)期的cDNA作模板，以組成型表達(dá)的花生AhActin基因作為內(nèi)參，目的基因和內(nèi)參基因引物序列為：AhGa2oxF： ACCCACATTCCCTACATCC， AhGA2oxR： GACCTTGAAGAAGCCATAGTC， AhActinF： GTCATCGTCATCCTCTTCTC， AhActinR： CATTCCTGTTCCATTGTCAC。采用FastStart SYBR Green試劑盒（Roche）按說明書進(jìn)行操作。

用ABI PRISM 7900HT實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋翰襟E1預(yù)變性95℃ 10 s；步驟2兩步法擴(kuò)增95℃ 5 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；步驟3熔解曲線95℃ 0 s，60℃ 15 s，95℃ 0 s。每個(gè)反應(yīng)管均設(shè)置重復(fù)管，重復(fù)試驗(yàn)3次。根據(jù)溶解曲線檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性。基因表達(dá)水平通過 2-△△CT 方法計(jì)算。

2結(jié)果與分析

21AhGA2ox基因全長的獲得

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共獲得了72 527 條unigenes。序列聚類分析和BlastX比對(duì)結(jié)果顯示其中一條820 bp的序列注釋為GA2ox，與其他植物GA2ox基因相比5′端缺少大約380 bp，利用RACE技術(shù)獲得該序列的5′-末端，拼接后設(shè)計(jì)引物克隆獲得AhGA2ox的全長開放閱讀框（ORF）1 014 bp （圖1）。

22AhGA2ox蛋白序列分析

利用Expert Protein Analysis System在線服務(wù)對(duì)AhGA2ox進(jìn)行分析，結(jié)果表明AhGA2ox編碼的蛋白含338個(gè)氨基酸，分子量為379 kD，等電點(diǎn)為844。由序列分析可知，該蛋白含有20種氨基酸（表1），疏水性氨基酸占453%，親水性氨基酸占386%，堿性氨基酸占13%，酸性氨基酸占98%。其中有16個(gè)含S氨基酸。

將花生GA2ox的序列與其他10種植物GA2ox蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同物種間GA2ox的同源性較低，花生與其它植物的GA2ox只有60%左右的相似性（圖2）。為了確定AhGA2ox的進(jìn)化位置，用11種植物GA2ox氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示花生GA2ox與同屬豆科的紅豆GA2ox和豇豆GA2ox親緣關(guān)系較近。

使用TMHMM在線預(yù)測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，AhGA2ox不存在信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)示該蛋白在細(xì)胞內(nèi)不會(huì)發(fā)生遷移，該結(jié)果與DNS（http：//mendelimpacat/sat/DNS/DNShtml）的在線服務(wù)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。用Predict Protein（http：//wwwpredictproteinorg）網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)AhGA2ox編碼的蛋白進(jìn)行可溶性分析，結(jié)果表明有582%的氨基酸殘基暴露在外，可與溶劑接觸，可判斷該蛋白為可溶性蛋白。利用predict protein在線服務(wù)對(duì)AhGA2ox進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在GA2ox蛋白中，螺旋結(jié)構(gòu)占2493%，折疊結(jié)構(gòu)占1632%，環(huán)肽鏈占5875%。GA2ox與2-酮戊二酸相結(jié)合的保守序列，基本由折疊結(jié)構(gòu)和環(huán)肽鏈結(jié)構(gòu)組成。

利用Expasy的ProtScale在線預(yù)測(cè)AhGA2ox的疏水性（圖4），結(jié)果表明該蛋白的疏水性最大值為2322，最小值為-2344。從圖中可以看出，AhGA2ox編碼蛋白的疏水區(qū)域與親水區(qū)域是交替出現(xiàn)的，在第180個(gè)氨基酸附近的疏水區(qū)域可能與GA2ox的功能結(jié)構(gòu)域有關(guān)。

23AhGA2ox的表達(dá)模式分析

本研究通過qRT-PCR方法檢測(cè)了AhGA2ox的表達(dá)情況，AhActin為參照基因。結(jié)果表明，花生GA2ox在果針、花、莖、葉、根、種子中都有表達(dá)（圖5）。根據(jù)該基因各個(gè)組織的Ct值，經(jīng)2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)AhGA2ox在成年期植株的葉中表達(dá)量最高，其次，在根及入土3天的果針中表達(dá)也相對(duì)較高，表達(dá)量最低的是成年的莖。

1：未入土果針；2：入土3天果針；3：入土9天果針；4：花；

5：成年期莖；6：幼年期莖；7：成年期葉；8：幼年期葉；9：根；10：種子

3討論

GA2-氧化酶是在赤霉素合成過程中催化生物活性赤霉素失活的關(guān)鍵酶[13]，在小麥、番茄、煙草等植物中異源表達(dá)AtGA2ox會(huì)使植株矮化[14～16]。GA2-氧化酶基因?qū)儆?0G-Fe（Ⅱ） oxygenase superfamily基因家族，其中擬南芥中鑒定了8個(gè)不同的GA2ox基因[17]，大豆中注釋GA2ox的有7個(gè)基因。1999年Martin等[18]人在豌豆中鑒定了兩個(gè)GA2ox的cDNA，2003年Agrawal等鑒定了兩個(gè)水稻GA2ox基因。

本研究克隆得到花生的一個(gè)GA2ox基因，通過對(duì)這個(gè)基因的生物信息學(xué)分析，可以確認(rèn)它是GA2ox基因家族中的一員，是一種氧化還原酶類的雙加氧酶，以2-酮戊二酸為底物，催化赤霉素失去生物活性。AhGA2ox具有該蛋白家族共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，含有保守的20G-FeⅡ-Oxy蛋白結(jié)構(gòu)域，還有高度保守的與2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)（Arg-272、Ser-274）和Fe2+結(jié)合位點(diǎn)（His-205、Asp-207、His-262），這表明AhGA2ox屬于GA2-氧化酶家族。

研究表明，擬南芥8種GA2ox基因表達(dá)模式有所不同，如AtGA2ox1和AtGA2ox2在花、莖和莢果中表達(dá)量高，在葉中表達(dá)量低；而AtGA2ox3在這些組織中檢測(cè)不到表達(dá)。我們對(duì)花生GA2ox表達(dá)分析研究發(fā)現(xiàn)，在花生幼年期的各組織中表達(dá)量較低，而在成年期的葉片和根中表達(dá)量較高。赤霉素在植物生長發(fā)育過程中起重要作用，而AhGA2ox表達(dá)模式的不同暗示AhGA2ox通過負(fù)調(diào)控赤霉素合成，在花生不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中起作用。另外，在花生莢果發(fā)育過程中，果針入土后3天時(shí)GA2ox的表達(dá)量明顯升高，暗示赤霉素在花生莢果發(fā)育初期起到重要的調(diào)控作用。

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