水稻黑條矮縮病毒RNA干擾載體的構建及遺傳轉化

摘要：針對水稻黑條矮縮病毒S6、S10兩條RNA雙鏈，參考相關文獻，設計了2對引物，通過RT-PCR獲得了2條干擾片段，將這些干擾片段分別構建到RNA干擾載體中，進一步將整個RNA干擾片段構建入以玉米泛素Ubi為啟動子、以生物安全性的bar基因為選擇標記的植物雙元表達載體pCA1300-Ubi中，經農桿菌介導對黃淮稻區主栽水稻品種圣稻13進行遺傳轉化，為下一步對水稻黑條矮縮病的研究及抗性品種的培育提供候選材料。

關鍵詞：水稻黑條矮縮病；RNA干擾（RNAi）；Ubi啟動子；bar基因

中圖分類號：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0019-06

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，亞洲近3/4的人口以食用稻米為主。目前我國水稻常年種植面積約占全國糧食種植面積的30%，其產量占我國糧食總產量的40%以上。因此，稻米產量的高低及品質的優劣直接關系到人們的生活及健康，已受到人們越來越多的重視。

水稻黑條矮縮病（ rice black-streaked dwarf disease， RBSDD） 是由水稻黑條矮縮病毒引起的、由灰飛虱傳播的一種病毒病，主要分布于中國、朝鮮、韓國和日本等東亞國家和地區， 對水稻、大麥、小麥、玉米等禾谷類作物造成危害。在20世紀60年代，該病曾廣泛發生在我國華東諸市， 之后有一段沉寂期；20世紀90年代后期， 該病在浙江省再次爆發流行， 且蔓延速度非常快，對包括浙江、上海、江蘇、安徽、江西以及福建北部在內的長江流域中東部整個稻作區的水稻生產造成毀滅性危害，發病田塊一般減產10%～40%，重病田甚至絕產，造成了巨大的經濟損失[1]。目前，對于水稻黑條矮縮病的防治主要是農藥防治傳毒介體灰飛虱，但由于介體昆蟲種群數量大，防治效果不佳且對環境的影響較大。種植抗病品種是減輕農作物病蟲害最經濟、有效和環保的途徑，但目前還未篩選到優良的抗水稻黑條矮縮病的抗性品種，因此篩選和培育抗水稻黑條矮縮病的水稻新品種顯的尤為重要。

水稻黑條矮縮病毒（ Rice black-streaked dwarf virus， RBSDV） 屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fijivirus），全基因組測序工作已經完成，總長29 141 bp，至少含有13個開放閱讀框[2， 3]，由10條dsRNA組成，按分子量大小分別命名為S1～S10，這10條基因組片段均具有保守的末端寡核苷酸片段 （5′GUUUUU-and-GUC 3′），該末端序列的保守性被確定為植物呼腸孤病毒科分類的一個重要標準，是病毒RNA而非寄主RNA包裝的信號[4， 5]。其中病毒RNA 依賴的RNA 聚合酶、外殼蛋白、沉默抑制子等重要基因的功能已經基本明確，本研究選取的RBSDV基因組中S6、S10基因編碼的蛋白分別為RNA沉默抑制子[6]和病毒外層衣殼。這為進一步利用基因工程手段培育轉基因水稻抗病新品種奠定了基礎。

RNA干擾是指設計合成與病毒同源的dsRNA，導入植物體并形成發夾結構，在植物體內對病毒基因組進行特異性酶切降解，抑制病毒擴張，從而使植物具有抗病毒能力。由于該方法可有效抑制目的基因的表達，對目的基因的表達具有可控性，近年來被廣泛應用于新品種的培育。本實驗參照水稻黑條矮縮病毒基因組中S6、S10的部分片段構建了RNA干擾載體，進一步通過農桿菌介導對水稻愈傷組織進行遺傳轉化，獲得了部分轉基因陽性植株，為下一步抗水稻黑條矮縮病水稻材料的篩選及培育提供了候選材料。

1材料與方法

11植物材料

正常及感染黑條矮縮病的水稻材料，均于2010年取自山東省農業科學院水稻研究所濟寧水稻試驗田自發病水稻植株，經液氮速凍后置于干冰內保存，帶回實驗室后迅速置于-70℃下保存備用。

12菌株及載體

大腸桿菌DH5α感受態購自Trangen公司；農桿菌LBA4404由本實驗室保存；克隆載體pMD18-T購自Takara公司；植物表達載體pCA1300-Ubi為山東農業大學溫孚江教授饋贈。

實驗中使用的所有限制性內切酶、RNase A、Taq DNA Polymerase、T4 DNA ligase以及RNA反轉錄試劑盒Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A）等均購自Takara公司（大連寶生物）；質粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒等購自天根生化科技有限公司（北京）；全氏金Trizol試劑（Code：ET101-01）購于濟南雨同生物科技有限公司；氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等抗生素均購自美國Amerisco公司；其他藥品及試劑均為國產分析純。

13感染RBSDV水稻葉片總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成

利用傳統Trizol法提取感染水稻黑條矮縮病毒水稻葉片的總RNA。

15病毒S6、S10干擾片段的獲得

以感染RBSDV的水稻葉片總RNA反轉錄后的第一鏈cDNA為模板，利用片段 S6、S10的特異性引物進行PCR擴增，反應體系（25 μl）為：10×PCR buffer 25 μl、25 mmol/L dNTPs 1 μl、10 μmol/L上、下游引物各05 μl、單鏈cDNA 2 μl、Ex Taq DNA Polymerase 03 μl、ddH2O 182 μl；擴增條件為：94℃解鏈10 min；之后 94℃ 45 s， 56℃ 30 s， 72℃ 1 min， 共35個循環；最后72℃延伸10 min。最終獲得了RBSDV S6、S10的DNA片段。獲得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，與克隆載體pMD18-T連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化細胞在LB平板上生成菌落，挑取部分菌落經菌液PCR鑒定，對可能的陽性菌落提取質粒，進一步用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ進行雙酶切鑒定。對酶切鑒定陽性的重組質粒送山東省農科院高新技術研究中心測序室進行測序，將測序結果與NCBI網站上提供的序列應用DNAMAN軟件進行核苷酸序列同源性比對。

16RNA干擾載體的構建

改造的載體pUC19由中國科學院遺傳與發育研究所提供，在原有pUC19多克隆位點處插入一段兩側各含有一對同尾酶即BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ以及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ的內含子片段，同尾酶方向相反。通過BamH Ⅰ和Sal Ⅰ分別將載體pMD18T-RBSDV-S6、pMD18T-RBSDV-S10中的干擾片段雙酶切下來，將切下的目的片段回收，與用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ同樣處理的pUC19干擾載體連接，并轉化大腸桿菌DH5α，將得到的重組載體提取質粒后，經Pst Ⅰ單酶切檢測，將上述得到的質粒進一步用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切，與經BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切的載體pMD18T-RBSDV-S6、pMD18T-RBSDV-S10中的干擾片段連接，經轉化大腸桿菌DH5α，得到重組載體，在此過程中外源插入的干擾片段通過兩對同尾酶分別正向和反向構建入干擾載體中，且互補配對與內含子形成發夾結構，達到RNA干擾的目的，將構建成功的干擾載體分別命名為pUC19-RNAi-S6、pUC19-RNAi-S10。

17S6、S10干擾片段表達載體的構建

本研究所用的植物雙元表達載體為山東農業大學溫孚江教授饋贈的經改造的pCAMBIA1300載體，改造后該載體由玉米泛素Ubi啟動子驅動，以生物安全性的bar基因作為選擇標記，改造后載體命名為pCA1300-Ubi。將已構建入RNA干擾載體中的干擾序列的整體部分用Pst Ⅰ單酶切，進一步將其構建入雙元表達載體pCA1300-Ubi中，轉化大腸桿菌并挑取部分菌落進行菌液PCR鑒定，對可能的陽性菌落提取質粒，經Pst Ⅰ酶切鑒定后獲得陽性重組質粒pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10。

18農桿菌介導的水稻遺傳轉化

將上步構建成功的RBSDVS6、RBSDVS10干擾片段的雙元植物表達載體pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10用熱激法轉入農桿菌菌株LBA4404感受態中，經28℃培養兩天獲得單菌落，挑取部分單菌落經菌液PCR篩選鑒定，獲得陽性克隆。將陽性克隆在培養基上劃線后，挑取單克隆進一步培養獲得菌液。

水稻轉化品種為黃淮區主栽水稻品種圣稻13，水稻成熟胚遺傳轉化參照王薇[7]的方法進行。誘導出的水稻成熟胚愈傷組織與陽性農桿菌菌液共培養后，用10 mg/ml的Basta進行3次抗性篩選，經誘導及分化，獲得部分轉基因組培苗。

2結果與分析

21病毒S6、S10干擾片段的獲得

以感染水稻黑條矮縮病的水稻葉片總RNA反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，利用根據RBSDV雙鏈RNA片段 S6、S10設計的特異性引物進行RT-PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳獲得大小分別為276、244 bp的條帶（如圖1），與預期RBSDVS6、RBSDVS10相應條帶大小一致，產物經回收并測序，與NCBI網站上提供的相應序列應用DNAMAN軟件進行核苷酸序列同源性比對，相似性達到100%，證明為目的片段。

將回收后的片段連接入克隆載體pMD18-T并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化細胞在LB平板上生成菌落，挑取部分菌落經菌液PCR鑒定，對可能的陽性菌落提取質粒，進一步用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ進行雙酶切鑒定，證明載體構建成功。

22pUC19-RNAi-RBSDVS6、pUC19-RNAi-RBSDVS10干擾載體的構建

干擾載體pUC19-RNAi中內含子的兩端各含有一對同尾酶，即BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ以及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ，且它們方向正好相反，這樣就可以先通過BamH Ⅰ和Sal Ⅰ分別將載體pMD18T-RBSDV-S6、pMD18T-RBSDV-S10中的干擾片段雙酶切下來，正向連入pUC19-RNAi載體，然后再用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ雙酶切此干擾載體，將干擾片段反向連入，獲得含有正反向S6、S10序列的RNA干擾載體（如圖2）。

23pCA1300-Ubi-RNAi-RBSDV 系列植物雙元表達載體的構建

經改造的pCambia1300表達載體添加了玉米泛素（Ubi）啟動子來啟動目的基因的表達，同時下游插入了由組成型35S啟動子驅動的bar基因作為選擇標記，重新命名為pCA1300-Ubi。將上述構建好的干擾載體中的正反向RBSDV干擾片段經PstⅠ單酶切克隆入pCA1300-Ubi載體中，重命名為pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10。以RBSDV片段S6為例，構建成功的表達載體圖譜如圖3。將構建好的雙元表達載體分別經Pst Ⅰ酶切并電泳鑒定，獲得酶切產物且大小均分別與預期相符合，證明載體構建成功（如圖4）。

24農桿菌介導的水稻轉化

將鑒定好的含目的干擾片段的系列雙元植物表達載體pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10分別轉入農桿菌LBA4404中，以轉化的農桿菌菌液作為模板進行PCR擴增，鑒定目的片段是否成功轉入。農桿菌菌液PCR鑒定結果如圖5。

以鑒定為陽性的農桿品種菌單菌落進行液體培養獲得菌液，以之侵染水稻品種圣稻13成熟胚愈傷組織，經共轉化后，進一步經繼代及Basta抗性篩選，獲得轉化植株。

3討論

RNA干擾是指一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘導細胞表現出特定基因缺失的表型，因為這是一種在RNA水平的基因表達抑制，故稱為RNA干擾（RNAi）[8]。實現RNA干擾的途徑有多種，其中一種就是采用基因片段連接成反向重復序列的方法，使表達的單鏈RNA自我配對形成發夾結構RNA（hpRNA），發夾莖部形成穩定的dsRNA從而誘導同源的內源基因沉默。利用該原理可設計合成與病毒同源的dsRNA，針對靶標基因構建具有反向重復結構的沉默載體，轉化植物后可形成dsRNA，引發植物體內的RNAi機制[9]，使靶標基因在轉錄后發生沉默，抑制病毒基因組的擴張。發夾結構導入植物后形成的dsRNA能實現RNA的穩定干擾，從而獲得抗病毒的植物新品種。

RNAi技術應用于水稻抗病毒基因工程改良的研究已有許多成功的例證，Pinto等[10]將編碼水稻黃斑病毒 （RYMV） 的一個關鍵酶基因轉入水稻，誘發該基因沉默，從而培育成具有水稻黃斑病毒抗性的水稻抗病新品種，且該抗病性能穩定遺傳3代。Zhou等[11]將RSV病毒外殼蛋白（CP）基因和特異蛋白（SP）基因組合到同一干擾載體中，將此干擾載體轉化到易感品種中，純合子第5代和第7代自交后表現出很強的抗病毒能力，而且RT-PCR結果顯示，在轉基因植株中病毒的CP和SP基因表達被顯著抑制，且野生型和轉基因植株在形態及發育上無明顯差異，轉基因植株產量較高、品質較好。梁國華等[12]利用水稻黑條矮縮病S8基因片段構建了RNA干擾載體轉化水稻，獲得了對水稻黑條矮縮病具有良好抗性的轉基因水稻植株。

本研究以RBSDV病毒基因組中S6基因和S10基因作為靶基因，構建RNAi載體，其中S6全長為2 645 bp，含有一個開放閱讀框，編碼非結構蛋白P6，研究發現該蛋白具有RNA沉默抑制子的功能，并且在無其他病毒蛋白和RNAs條件下可以自我互作形成病毒粒子，在病毒的形態建成中發揮重要作用，該基因的有效沉默將影響病毒在作物體內的繁殖和擴增[13]。S10全長為1 801 bp，含有一個開放閱讀框，編碼病毒外層衣殼蛋白P10，P10具有自作用和低聚特性，通過N-端1～230個氨基酸的區域來實現自我的互作；其低聚物的形成需要依賴其他的病毒蛋白，從而形成水稻黑條矮縮病毒粒子的基礎結構外殼[14]，該基因的有效沉默將影響病毒的形成，從而抑制病毒在作物體內的發展。

根據病毒基因組中不同基因設計的RNAi沉默載體轉化水稻后獲得的轉基因植株對病毒的抗性存在差異。Shimizu等[15]研究發現針對RSV的pC3（編碼核酸蛋白）基因和pC4（編碼運動蛋白）基因構建的具有反向重復序列的RNAi載體轉化水稻后可獲得對病毒免疫的植株，而針對RSV pC2（編碼糖蛋白，功能未知）基因和p4（編碼主要非結構蛋白，功能尚不明確）基因設計的RNAi載體轉化水稻后對病毒無抗性。這也說明了并不是所有針對病毒核酸的干擾載體在抗病毒方面具有同效作用。因此本實驗前期工作中針對水稻黑條矮縮病毒不同dsRNA設計了一系列引物，目前已經獲得了包括S6、S10在內的7個RBSDV干擾載體，并將它們分別轉化黃淮稻區主栽水稻品種圣稻13成熟胚愈傷組織中，部分干擾載體已經獲得了相應的轉基因陽性材料，擬進一步對獲得的材料進行抗病毒鑒定，為進一步篩選并培育抗病毒水稻植株提供候選材料。鑒于目前生產實踐中還未發現具有抗水稻黑條矮縮病的相關種質資源，該方面的研究具有一定的實際意義及應用價值。參考文獻：

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