嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ—1角蛋白酶底物特性及酶活測定方法研究

摘要：從羽毛加工廠污泥中分離到一株嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia ）YHYJ-1，對羽毛、羊毛和毛發底物均具有降解作用。菌株YHYJ-1對不同底物的降解能力存在差異，培養36 h羽毛完全降解，羊毛降解時間是72 h，毛發則在84 h有部分降解作用。分別以可溶性羽毛角蛋白、羽毛粉和偶氮角蛋白為底物進行酶活測定，以最高酶活值設定為100%，3種底物的相對酶活分別為100%、651%和232%，表明菌株YHYJ-1角蛋白酶的最適底物為可溶性角蛋白。菌株YHYJ-1接種于羽毛粉培養基， 培養20 h后角蛋白酶活性急劇升高，28 h酶活達最大值，之后快速下降。

關鍵詞：嗜麥芽窄食單胞菌；羽毛；角蛋白質；角蛋白酶

中圖分類號：Q9399文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0096-04

角蛋白質是廣泛存在于羽毛、毛發、鱗片、蹄、角等組織中的硬性蛋白，是一類具有巨大潛在應用價值的廢棄蛋白質資源。角蛋白含有大量高度交聯的二硫鍵結構，不易被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解[1]，限制了其應用。角蛋白分為α-角蛋白和β-角蛋白兩種。α-角蛋白是毛發的主要構成組分，β-角蛋白多見于羽毛中[2]。角蛋白可被微生物分泌的角蛋白酶降解。不同種類微生物產生的角蛋白酶性能存在差異，特別表現于底物特性不同。角蛋白酶底物特性是研究微生物降解角蛋白質降解機理的基礎。

角蛋白不溶于水及大部分有機溶劑，其活性測定比一般蛋白酶困難。目前測定角蛋白酶的方法主要有3種，一是直接用角蛋白粉（羽毛粉）作為底物[3]；二是使用經過修飾的底物偶氮角蛋白[4]或天青角蛋白[5]；三是以可溶性羽毛角蛋白作為底物[6]。

本實驗室從羽毛加工廠污泥中分離到一株高效降解角蛋白質的嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1，并研究了該菌株YHYJ–1的底物特異性，篩選出了最佳酶活測定方法，測定了菌株產角蛋白酶變化曲線，為深入研究其降解角蛋白質的機理提供了依據。

1材料與方法

11供試菌株與材料

嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） YHYJ-1，山東省農業科學院高新技術研究中心微生物實驗室保存。

羽毛及羽毛粉：從肉雞屠宰廠取雞毛，洗滌劑漂洗，自來水沖洗后121℃高壓滅菌25 min，再用蒸餾水充分洗凈，80℃烘干。羽毛球磨粉碎過100目篩即羽毛粉。

羊毛與毛發：羊毛來自山東省農業科學院肉羊養殖廠，毛發來自理發店。自來水清洗，烘至恒重。

羽毛/羊毛/毛發培養基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛/羊毛/毛發5 g。

羽毛粉培養基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛粉10 g。

12角蛋白酶底物特異性

在羽毛、羊毛和毛發培養基上接種1%的YHYJ-1菌株培養液，37℃、180 r/min培養，觀察YHYJ-1菌株對3種底物的降解情況。

菌株發酵液蛋白含量測定：采用Bradford（1976）[7]的方法進行蛋白質濃度測定，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。菌株YHYJ-1接種于羽毛、羊毛及毛發培養基中，每12 h取樣1次，測定蛋白質含量。

13角蛋白酶活性測定方法

角蛋白粗酶液的制備：以1%的接種量接種于羽毛粉培養基，37℃、180 r/min培養24 h。4℃、12 000 r/min離心10 min，上清即為角蛋白粗酶液。

可溶性角蛋白、羽毛粉為底物的酶活測定方法參照Vermelho（2010）[8]的方法并加以改進：300 μl酶液加300 μl 06%可溶性角蛋白（羽毛粉）底物，50℃水浴反應30 min后加入300 μl 04 mol/L TCA終止反應。并以10 000 r/min離心10 min，于280 nm處測定吸光度。空白實驗條件同實驗組，在加角蛋白粗酶液前加300 μl 04 mol/L TCA提前終止反應。酶活性單位（U）定義為：混合液反應30 min后在280 nm的OD值比對照升高001定義為1 U。

偶氮角蛋白為底物的酶活測定方法參照Lin （1992）[4]的方法。酶活性單位（U）定義為：混合液反應30 min后在595 nm的OD值比對照升高001定義為1 U。

可溶性角蛋白的制備參照Wawrzkiewicz（1987）[6]的方法略有改動：剪去羽毛羽軸，加入甲醇∶氯仿（體積比1∶1）中，37℃放置30 min脫脂；脫脂的羽毛放入肥皂水中，42℃浸泡12 h；蒸餾水洗滌羽毛，40℃烘干；稱取5 g烘干的羽毛，加入500 ml二甲基亞砜，100℃回流浸提2 h；加入2倍體積冷的丙酮沉淀角蛋白，-20℃放置24 h；8 000 r/min離心5 min，棄上清；用冷的丙酮洗兩次后用蒸餾水洗兩次；40℃烘干后，研成粉末即為可溶性角蛋白。

14嗜麥芽窄食單胞菌發酵產酶試驗

利用瑞士產KLF2000型全自動發酵罐研究菌株產酶性能。羽毛粉培養基，裝量26L/37L，接種量1%。培養條件為37℃，980 r/min。每4 h取樣1次，離心后測定發酵液酶活性，繪制嗜麥芽窄食單胞菌產酶曲線。

2結果與分析

21角蛋白酶底物特異性

以羽毛、羊毛和毛發為唯一碳氮源研究嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1的底物利用特性。結果表明，YHYJ-1菌株對羽毛的降解最快，培養24 h后除羽軸外全部降解，36 h后包括羽軸在內全部降解。菌株對羊毛的降解相對較慢，36 h后羊毛開始斷裂，有明顯降解。72 h后，羊毛全部降解。菌株對毛發的降解最為緩慢，48 h后始發現培養基有渾濁現象，84 h后毛發出現斷裂降解現象，但繼續培養未發現進一步降解（圖1）。

22發酵液蛋白質含量

發酵液可溶性蛋白質含量變化反映了菌株對角蛋白質的降解情況。結果表明，各底物處理隨培養時間延長，培養液蛋白質含量均呈上升趨勢，但底物間差異明顯。以羽毛為底物培養液蛋白質含量12 h內快速升高，24 h后進入平穩期，60 h后蛋白含量呈緩慢下降趨勢。以羊毛為底物時，培養液蛋白質含量0～48 h持續升高，之后進入平穩期并維持較高含量水平。以毛發為底物培養液蛋白質含量增加緩慢，且水平明顯低于羽毛和毛發底物處理，說明菌株對毛發的降解能力相對較弱（圖2）。23酶活測定方法研究

分別以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉為底物，測定培養液角蛋白酶活性，以最高酶活為100%。結果表明，以可溶性角蛋白為底物酶活最高（100%），其次為羽毛粉底物（為可溶性角蛋白底物的651%），偶氮角蛋白底物的酶活僅為可溶性角蛋白底物的232%。測定過程還發現，以羽毛粉做底物的測定結果不穩定，不適合作為底物。上述結果表明，研究嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1的角蛋白酶特性的最適宜底物為可溶性角蛋白質。

24嗜麥芽窄食單胞菌發酵產酶曲線

以羽毛粉為底物對嗜麥芽窄食單胞菌進行發酵，接種培養20 h后角蛋白酶活性快速升高，28 h達到最大值，之后急劇下降，48 h后酶活降到很低水平（圖3）。

嗜麥芽窄食假單胞菌屬于革蘭氏陰性原核微生物，大都為條件致病菌，限制了其應用。現代分子生物學技術注重高效功能基因資源的研究與開發，近年來已有關于嗜麥芽窄食假單胞菌產蛋白酶及降解羽毛功能的報道[9～11]。本實驗室分離到一株能在36 h內完全降解羽毛的嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1，其效率遠高于之前的文獻報道[1，12～14]。研究表明，菌株YHYJ-1對羽毛、羊毛和毛發底物均具有降解作用，但不同底物間的降解能力存在差異。該菌株能在培養36 h完全降解羽毛，對羊毛的降解時間為72 h，毛發底物則在84 h有部分降解作用，顯示了其對羽毛角蛋白的高效降解功能。為研究菌株YHYJ-1的角蛋白酶性能，分別以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉為底物測定其活性，從而確定了該菌株產生角蛋白酶的最適底物為可溶性角蛋白 。對菌株YHYJ-1產角蛋白酶變化研究表明，羽毛粉培養基中接種培養28 h角蛋白酶活性達最高值 ，酶活性隨時間推移，菌株降解羽毛的進程加快，發酵液可溶性蛋白質含量增加，且變化趨勢一致 。表明嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1降解羽毛角蛋白質機理主要是角蛋白酶作用。上述研究結果對研究嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1降解角蛋白質機理提供了理論基礎。參考文獻：

[1]Williams C M， Richter C S， MacKenzie J M， et al Isolation， identification， and characterization of a feather-degrading bacterium [J] Applied Enviorn Microbiol， 1990， 56（6）：1509-1515

[2]Parry D A， North A C Hard α–keratin intermediate filament chains： suvstructure of the N- and C-terminal domains and the predicted structure and function of the C-terminal domains of type I and type II chains[J] Journal of Structural Biology， 1998， 122（1-2）：279-290

[3]涂國全，孫宇暉，郭美錦，等.鏈霉菌分解角蛋白的生化機制研究[J].江西農業大學學報，1998，20（2）：164-169.

[4]Lin X， Lee C G， Casale E S， et al Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus lieheniformis strain[J] Appl Environ Microbiol， 1992， 58（10）： 3271-3275

[5]Suntornsuk W， Suntornsuk L Feather degradation by Bacillus sp FK 46 in submerged cultivation[J] Bioresource Teehnol， 2003， 86（3）：239-243

[6]Wawrzkiewicz K， Lobarzewski J， Wolski T Intracellular keratinase of Trichophyton gallinae[J] J Med Vet Mycol， 1987， 25： 261-268

[7]Bradford M M A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutlizing the principle of protein-dye binding[J] Analytical Biochemistry， 1976， 72：248-254

[8]Vermelho A B， Mazotto A M，de Melo A C， et al Identification of a Candida parapsilosis strain producing extracellular serine peptidase with keratinolytic activity[J] Mycopathologia， 2010， 169（1）： 57-65

[9]Windhorst S， Frank E， Georgieva D N， et al The major extracellular protease of the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia： characterization of the protein and molecular cloning of the gene[J] J l Bio Chem， 2002， 277 （13）： 11042-11049

[10]Cao Z J， Zhang Q， Wei D K， et al Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme[J] J Ind MicrobiolBiotechnol， 2009， 36（2）： 181-188

[11]DeToni C H， Richter M F， Chagas J R， et al Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from a feather-degrading Xanthomonas maltophilia strain[J] Can J Microbiol， 2002， 48（4）： 342-348

[12]Cai C G， Ceng G S， Qi J J， et al Purification and chracterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain[J] J Zhejiang Univ Sci B， 2008， 9 （9）： 713-720

[13]Thys R C， Lucas F S， Riffel1 A， et al Characterization of a protease of a feather-degrading Microbacterium species[J] Letters in Applied Microbiology， 2004， 39（2）： 181-186

[14 ]Sangali S， Brandelli A Isolation and characterized of a novel feather-degrading bacterial strain [J]App Biochem Biotech， 2000，87（1）：17-24山 東 農 業 科 學2013，45（1）：100～103，106Shandong Agricultural Sciences