滑菇子實體多糖提取條件優(yōu)化及抗氧化活性研究

摘要：滑菇子實體多糖（fruiting body polysaccharide，F(xiàn)PS）在抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有重要作用。通過Plackett- Burman試驗和響應(yīng)面方法得到FPS的最佳提取條件：提取次數(shù)255，乙醇濃度95%，乙醇倍數(shù)322倍，其理論預(yù)測值為2488%；對提取參數(shù)取整后，其實驗值為2453%。在FPS濃度為500 mg/L時，對羥基自由基、超氧陰離子和DPPH的自由基清除率分別為1151%、2337%和2019%，其還原力為011，表明滑菇子實體多糖具有一定抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：滑菇；子實體多糖；提取；抗氧化

中圖分類號：TS244文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0117-05

滑菇（Pholiota nameko）又名光帽鱗傘、光帽黃傘，是一種冬、春季發(fā)生的菌蓋粘滑的木腐菌，屬球蓋菇科鱗傘屬。在自然界多生長于殼斗科等闊葉樹的倒木或樹樁上，松木或未完全死亡的闊葉樹干上也能生長[1]。子實體含豐富的多糖，能提高機(jī)體的免疫力[2，3]。

多糖是自然界中含量最豐富的一種生物聚合物，具有能量儲存、結(jié)構(gòu)支持、防御和抗原決定性等功能。多糖是來自于高等動植物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁的天然大分子物質(zhì)，是所有生命體的重要組成成分與維持生命所必須的結(jié)構(gòu)材料[4]。

提取滑菇子實體多糖的方法應(yīng)用較多的有常規(guī)水提法[2]、酶提取法[5，6]以及超聲波輔助法[7]。本研究利用水提法對滑菇子實體多糖進(jìn)行提取優(yōu)化，以提高多糖得率，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行檢測。

1材料與方法

11材料、試劑與儀器

111材料滑菇（泰安某超市購買）。

112 試劑鹽酸，氫氧化鈉，無水乙醇，乙醇（75%、85%、95%），苯酚，濃硫酸，去離子水，DPPH，磷酸緩沖液（pH 66、pH 74），磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，Tris-HCl，鄰苯三酚，Vc（5%），鄰二氮菲，硫酸亞鐵，氯化鐵，鐵氰化鉀，過氧化氫。

113 儀器752-N 紫外可見分光光度計，DZF-6021 型真空干燥箱，DK-S24 型恒溫水浴鍋，TGL–16B 型離心機(jī)，電子天平，粉碎機(jī)。

12試驗方法

121粗多糖提取滑菇子實體經(jīng)烘干、粉碎得滑菇粉末。稱取1 g滑菇粉末，放入燒杯中加入去離子水，在不同溫度和時間下浸提，浸提過程中要不斷攪拌。提取液中加入不同濃度乙醇，在不同溫度和時間條件下醇沉，得沉淀即為粗多糖，保存于冰箱中待用。

122多糖含量測定苯酚硫酸法[8]。準(zhǔn)確稱取01 g干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，加蒸餾水定容至100 ml容量瓶，從中吸取10 ml 再定容至100 ml容量瓶，即得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液02、04、06、08、10、12 ml，各以水補(bǔ)充至20 ml，加入6%苯酚（6%，新蒸）10 ml及濃硫酸50 ml，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min，另精密量取20 ml蒸餾水同法操作，作為空白對照。在可見分光光度計測OD490nm值，以O(shè)D值（Y）對葡萄糖含量（X）回歸，得回歸曲線方程：

Y=00147X – 00137 （R2 =0998） （1）

123Plackett–Burman（PB）試驗采用9因素3水平的PB試驗設(shè)計，PB試驗因素水平及編碼見表1。利用 Microsoft Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

124響應(yīng)面優(yōu)化根據(jù)PB試驗結(jié)果以及Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選擇對響應(yīng)值（子實體多糖提取量）影響顯著的提取次數(shù)、乙醇濃度、乙醇倍數(shù)進(jìn)行下一步試驗。每一自變量的低、中、高試驗水平分別以–1、0、1進(jìn)行編碼。該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達(dá)為：

YFPS=A0+∑Ai Xi+∑AiiXi2+∑AijXiXj（2）

式中：YFPS為響應(yīng)值（多糖得率），A0、Ai、Aii、Aij為方程系數(shù)，Xi、Xj（i≠j）為自變量編碼值。

125抗氧化活性測定

①清除羥自由基（·OH）：采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[9]。吸取15 ml鄰二氮菲溶液（5 mmol/L），加入pH 74（075 mol/L）磷酸鈉緩沖液4 ml ，充分混勻。再加入 FeSO4溶液（75 mmol/L） 1 ml ，立即混勻。分別加入不同濃度的樣品溶液4 ml ，立即混勻。加入15 ml去離子水，以補(bǔ)充體積。最后加入H2O2溶液（1%）1 ml，以去離子水代替H2O2溶液作為空白對照，輕輕混勻，37℃保溫90 min，于536 nm測定吸光度，BHT作陽性對照。

羥基自由基清除率計算公式：

·OH清除率（%）=（A加藥-AH2O2）/（A未損-AH2O2）×100 （3）

式中：吸光度A加藥為加入樣品（抗氧化劑）及H2O2，AH2O2為加H2O2而不加抗氧化劑，A未損為兩者都不加。

②清除超氧陰離子自由基（O-·2）[10]：反應(yīng)的終體積是10 ml，各試劑是：鄰苯三酚（3 mmol/L）05 ml ，多糖溶液（200、400、600、800、1000 mg/L）05 ml，Tris-HCl溶液（005 mmol/L，pH 82）9 ml。混合液在25℃下保持5 min，然后用分光光度計測定其OD420nm值。BHT作陽性對照。

O-·2清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100（4）

式中：A0為未加清除劑的吸光值； A1為加清除劑后的吸光值。

③清除DPPH自由基[11]：將不同濃度的多糖溶液2 ml與DPPH溶液（0 2 mmol/L ）2 ml 均勻混合，30 min后在525 nm處測定其吸光度Ai，同時按照該方法測定2 ml DPPH溶液（02 mmol/L ）與2 ml蒸餾水混合后的吸光度Ac，以及2 ml不同濃度多糖溶液與2 ml蒸餾水混合后的吸光度Aj。BHT作陽性對照。

清除率（%）=[1-（Ai -Aj）/Ac]×100（5）

④總還原力能力（T-AOC）：采用普魯士蘭法[12]。取試樣1 ml，加磷酸緩沖液（02 mol/L，pH 66）25 ml和鐵氰化鉀溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）25 ml，混合后50℃放置20 min，取出后流水冷卻，加入三氯乙酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）25 ml混合，3 000 r/min離心10 min后取混合液25 ml，加入蒸餾水25 ml和氯化鐵25 ml（質(zhì)量分?jǐn)?shù)01%），混勻，靜置10 min，以蒸餾水作為無還原能力的樣品對照調(diào)零，在700 nm處測定吸光度。吸光度越高，抗氧化性越好，還原力越強(qiáng)。BHT作陽性對照。

2結(jié)果與分析

21滑菇子實體多糖的提取優(yōu)化

211PB 單因子試驗PB試驗結(jié)果見表3，分析結(jié)果見表4。從表4可以看出，乙醇濃度、乙醇倍數(shù)、提取次數(shù)的P值分別為00021、00432和00001，表明該模型極顯著，即回歸偏差平方和所反映的波動明顯比剩余偏差平方和所反映的波動大，說明線型模型能夠很好地反映變量與自變量之間的變化規(guī)律。P值反映出各因素對多糖得率的影響，從中選出乙醇濃度、乙醇倍數(shù)和提取次數(shù)3個因素進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗。

212響應(yīng)面優(yōu)化[13]在響應(yīng)面試驗中，利用Response surface methodology（RSM）對提取次數(shù)、乙醇濃度和乙醇倍數(shù)3個因素進(jìn)行優(yōu)化（表5）。方差分析顯示，模型極顯著（P=00014），失擬值不顯著（P=00548），R2=09429，說明模型和現(xiàn)實的擬合程度很好。X1X2、X2X3、X1X3三個二次項不顯著，說明因素之間的影響不明顯，X32二次項極顯著，說明此因素影響顯著。X22不顯著，說明此因素影響不明顯。R-adj2=08695，說明該模型與實際試驗擬合程度不高，自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系不明顯（表6）。

22滑菇子實體多糖的抗氧化活性

221清除羥基自由基（·OH）由圖1可見，滑菇多糖對·OH具有一定的清除作用，清除率隨著濃度的增加而緩慢上升。當(dāng)滑菇多糖濃度為500 mg/L時，其清除率為1151%，相當(dāng)于BHT濃度為125 mg/L時的清除率。而BHT在0～500 mg/L之間清除率隨著濃度的增加而快速上升，到達(dá)500 mg/L時，清除率達(dá)到6083%。

222清除超氧陰離子（O-·2） 由圖2可見，滑菇子實體多糖對O-·2的清除作用比較好，當(dāng)滑菇多糖在0～300 mg/L之間時其清除率上升較緩慢，300～500 mg/L之間的清除率上升較快，到達(dá)500 mg/L時，清除率到達(dá)2337%。而BHT在0～300 mg/L之間時其清除率上升較快，之后上升較緩，到達(dá)500 mg/L時，清除率到達(dá)601%。

223清除DPPH自由基由圖3可見，隨著濃度的升高，清除率持續(xù)平穩(wěn)上升，達(dá)到500 mg/L時，清除率達(dá)2019%。而BHT對DPPH自由基的清除作用強(qiáng)于多糖，在0～300 mg/L之間時其清除率上升較快，之后隨著濃度升高清除率呈波動上升，到達(dá)500 mg/L時，清除率達(dá)5955%。

224還原力還原力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，抗氧化物質(zhì)通過提供電子可使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性。抗氧化活性同還原力是密切相關(guān)的，在700 nm下比色，以吸光值表示還原力的大小，吸光度值越大，表明樣品的還原力越強(qiáng)。

由圖4可見，滑菇子實體多糖的還原力隨濃度增加而增強(qiáng)，濃度在0～300 mg/L時，還原力增長緩慢，濃度在300～500 mg/L時，還原力增長開始變快，到達(dá)500 mg/L時吸光度值為011。相同濃度下BHT還原力明顯高于滑菇子實體多糖。

多糖的最佳提取條件：提取溫度80℃，提取次數(shù)3次，提取時間70 min，pH 9，加水倍數(shù)40，醇沉溫度常溫，醇沉乙醇濃度95%，醇沉?xí)r間16 h，醇沉乙醇倍數(shù)3倍。由響應(yīng)面方法得到FPS的最佳提取條件：提取次數(shù)255，乙醇濃度95%，乙醇倍數(shù)322倍，其理論預(yù)測值為2488%，對提取參數(shù)取整后，其實驗值為2453%。

以BHT為對照，測定了滑菇子實體多糖對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O-·2）和DPPH自由基的清除能力，同時用普魯士藍(lán)法測定總抗氧化能力。結(jié)果表明，多糖對·OH、O-·2、DPPH·均具有清除作用，在FPS濃度為500 mg/L時，對羥基自由基、超氧陰離子和DPPH自由基的清除率分別為1151%、2337%和2019%，其還原力為011，表明滑菇子實體多糖具有一定抗氧化能力。參考文獻(xiàn)：

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