花生脂肪酶基因的克隆分析及表達研究

摘要：脂肪酶是生物脂肪代謝過程中的重要酶系，在酶工程中具有重要應用價值。本研究利用花生未成熟種子的cDNA文庫，克隆了3種脂肪酶基因。序列分析表明，花生3種脂肪酶均具有保守的氨基酸序列和催化活性位點，分屬不同的脂肪酶家族。利用半定量RT-PCR對花生3種脂肪酶進行表達研究表明，它們在各組織中的表達模式各不相同，其中AhLipase2在種子萌發時期的子葉中表達量高，可能起到分解儲藏油脂，為幼苗生長提供營養的作用。

關鍵詞：花生；脂肪酶；基因克隆；表達分析

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0001-08

三酰甘油脂肪酶廣泛存在于生物體中，其主要功能是將三酰甘油（TAG）水解成甘油和游離的脂肪酸，同時具有水解和轉酰基的活性。在油料作物種子萌發過程中，種子儲藏油脂的分解為幼苗生長提供能量和碳骨架。脂肪酶催化脂肪分解的第一步反應，對于種子萌發和萌發后幼苗的生長具有重要意義。油料作物種子在儲藏過程中因為擠壓等原因可能引起脂肪分解的啟動，導致游離脂肪酸的積累，也是脂肪酶作用的結果，這些游離脂肪酸的氧化和降解作用導致食物的酸敗降低種子質量，并且影響了種子提取的食用油的質量。脂肪酶不僅是生物生理過程的重要酶系，還具有重要的工業利用價值。多種真菌和細菌來源的脂肪酶被分離純化，并廣泛應用于去垢劑、食品、造紙、有機合成、生物催化等方面[1]。

脂肪酶是脂肪代謝的重要酶系。在種子形成后期，TAG被儲存在種子油體中，由磷脂單分子層包被，脂肪酶只有附著在油水分界面時才會起作用[2]。種子萌發時期，磷脂酶使油體的磷脂單分子層產生缺陷，使脂肪酶能夠與TAG底物結合[3]。三酰甘油脂肪酶能夠在油/水表面將TAG水解成自由的脂肪酸和甘油，自由脂肪酸進入乙醛酸循環體，最終轉變成葡萄糖，為幼苗初期的生長提供能量[4]。但脂肪酶與脂肪相互作用的機理還不甚清楚，是脂肪代謝研究的重要問題[5]。在植物中，從玉米、蓖麻 （Ricinus communis）和紫苑草 （Vernonia galamensis）等種子中已經純化出脂肪酶[6，7]。近年來，一些在植物中編碼三酰甘油脂肪酶活性蛋白的基因被克隆[8～11]。對于植物來源的脂肪酶，一般根據N端序列可以將其分為三類，第一類存在于葉綠體中，第二類缺少N端信號序列，可能分布于胞質溶膠，第三類分布于線粒體中[12]。

目前商業化的脂肪酶主要來源于微生物，而植物脂肪酶具有潛在的重要價值，如利用植物脂肪酶來轉化植物油脂，生產生物柴油等[13]。花生是重要的油料作物，種子含油量高達50%以上，其中的三酰甘油為種子萌發和幼苗生長提供了充足的養分，脂肪酶在種子發育和萌發過程中起重要的作用。另外，脂肪酶還關系到花生的儲存和籽粒的品質，對下游加工具有重要影響。本實驗室已經對花生脂肪酸合成過程的基因進行了詳細分析[14～16]，本研究對脂肪降解酶基因進行克隆和分析，為全面了解花生油脂代謝奠定基礎。

1材料與方法

11植物材料

本研究以大田種植的魯花14號花生品種為材料，收集不同發育時期的種子，在液氮中速凍，保存于-80℃超低溫冰箱中，用于RNA的提取和cDNA文庫的構建。在盆栽條件下取萌發7天的花生子葉和萌發15天的真葉、莖、根，從大田生長的花生植株上收集花、果針和不同發育時期的種子在液氮中速凍，保存于-80℃超低溫冰箱中，用于RNA提取和基因表達的研究。

12試驗方法

121文庫構建和EST測序用于花生cDNA文庫構建的mRNA來源于不同發育階段的花生未成熟種子。200～500 mg花生種子用于總RNA 的提取，試驗方法按照RNAgent 試劑盒（Promega） 說明進行。mRNA 的分離和純化按照PolyATtract mRNA Isolation Systems 試劑盒（Promega） 進行。cDNA的合成和文庫構建按Stratagene pBluescript II cDNA文庫構建試劑盒進行。從文庫中隨機挑取克隆，用EZNA Plasmid Minipreps DNA Purification System（Omega Bio-Tek， USA） 制備質粒DNA。純化的質粒DNA用作模板，以T3或T7通用引物用BigDye Terminator v31 Cycle Sequencing Kit （ABI） 在ABI 3730XL 測序儀上進行測序。

122花生脂肪酶基因的克隆及序列分析通過測序獲得大量花生EST序列。將含有較多不可讀堿基的低質量序列、長度小于300 bp 的序列、載體序列以及引物序列去除。用Cap3軟件對EST 序列聚類分析。將獲得的contig和單個的EST 序列用BlastX 在最新NCBI 數據庫中（http：//wwwncbinlmnihgov/BLAST/）進行比對注釋。用Lasergene SeqMan II Module （DNAStar） （http：//www DNAStarcom） 進行編碼序列的預測。多序列比較用ClustalW183 software （http：//wwwchembnetorg/software/ClustalWhtml） 進行。在不同蛋白序列比較中不同顏色氨基酸殘基的標出用BoxShade program （http：//wwwchembnetorg/software/BOX_formhtml） 進行。

花生脂肪酶亞細胞定位預測使用TargetP11 Server （http：//wwwcbsdtudk/services/ TargetP/）和 WoLF PSORT（http：//wolfpsortorg/）。

123花生脂肪酶基因的表達分析從花生根、莖、葉、花、果針、種子以及種子萌發過程中的子葉中提取總RNA，以5 μg總RNA為模板，用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒（TaKaRa）合成第一鏈cDNA。根據克隆的花生脂肪酶基因序列設計基因特異性引物，以cDNA 為模板擴增目的基因片段，以花生actin 基因作為陽性對照和模板加樣參考。

2結果與分析

21花生脂肪酶cDNA序列的克隆

從花生未成熟種子cDNA 文庫中隨機挑選克隆，提取質粒DNA，以T3和T7通用引物進行大規模EST測序。對獲得的近 20 000條花生EST進行聚類分析，將獲得的contig群和singleton與NCBI數據庫中的序列比較，進行初步功能注釋。其中3條EST與數據庫中擬南芥等植物的脂肪酶基因有高度的同源性，且含有完整的開放讀碼框，分別命名為AhLipase1 （GenBank登錄號： GU902981），AhLipase2 （GenBank登錄號： GU902982），AhLipase3 （GenBank登錄號： GU902983）。AhLipase1基因ORF長度2 085 bp，編碼蛋白長度695 aa，相對分子量783 kD，預測的等電點（pI， isoelectric point）為688；AhLipase2基因ORF長度1 248 bp，編碼蛋白長度416 aa，相對分子量457 kD，預測的pI為660；AhLipase3基因ORF長度1 029 bp，編碼蛋白長度343 aa，相對分子量382 kD，預測的pI為848。各基因的開放讀碼框和對應編碼蛋白的序列如圖1所示。

花生3個脂肪酶蛋白間的差異較大，相互之間的相似性低于50%，而與GenBank中蛋白比對結果表明均屬于脂肪酶：AhLipase1與蓖麻（EEF39083）和毛果楊（EEE98509）脂肪酶蛋白相似性達74%；AhLipase2與苜蓿脂肪酶蛋白（AAR29056）相似性達81%。AhLipase3與蓖麻的另一脂肪酶蛋白（EEF51361）相似性達83%，與苜蓿的一個未知蛋白（ACJ85575）最為相近，相似性達89%。所以，預測花生的3種脂肪酶分別屬于不同的脂肪酶類型。

22花生脂肪酶序列分析

不同生物的脂肪酶蛋白均包含10個氨基酸組成的保守序列位點：[LIV]-X-[LIVAFY]- [LIAMVST]-G-[HYWV]-S-X-G-[GSTAC]，此基序中的絲氨酸為脂肪酶的活性位點，花生3種脂肪酶蛋白均含有此保守序列位點（圖1）。而3種脂肪酶活性位點的氨基酸組成有所不同：AhLipase1為LQFTGHSLGG，AhLipase2為PHYVGHSLGT，AhLipase3為IWLAGHSLGS。

根據推導的花生3種脂肪酶蛋白序列，使用TargetP 軟件對花生脂肪酶的亞細胞定位進行研究，預測結果表明：花生AhLipase1氨基端具有質體轉運肽，轉運肽由40個氨基酸組成，相對分子量約為42 ku，轉運肽切割位點預測在R和S之間（圖1）；AhLipase2 可能為分泌型蛋白，參與次生代謝過程，氨基端可能具有24個氨基酸組成的信號肽，信號肽切割位點預測在G和S之間（圖1）；AhLipase3 氨基端無轉運肽，可能存在于細胞質中。

23花生脂肪酶與其他植物來源的脂肪酶蛋白序列比較

在GenBank蛋白保守結構域數據庫檢索分析表明，3種花生脂肪酶都屬于酯酶和脂肪酶蛋白（Esterases and lipases）超級家族，均具有Lipase class 3 （Pfam 登錄號PF01764） 保守結構域。該保守區域包括一個由Ser-Asp-His/Glu 組成的三聯體催化活性中心，該活性位點包埋在蛋白結構內部，由一個“蓋子”所覆蓋，使其不能接近底物；當蛋白附著在油水界面時，“蓋子”會打開，使脂類底物接近活性位點。其中的絲氨酸活性位點位于保守序列 [LIV]-X-[LIVFY]-[LIVMST]-G-[HYWV]-S-X-G-[GSTAC]中（圖1），在AhLipase1中，活性位點分別位于：Ser-460、Asp-521 和His-609，AhLipase1保守區與其他植物脂肪酶的保守區相似性很高，10個氨基酸的保守序列與蓖麻和楊樹中的序列完全相同，其他活性位點周圍的氨基酸序列也很保守（圖2A）。在AhLipase2中，活性位點分別位于：Ser-187、Asp-266和His-305，其保守序列與其他植物中的對應序列相似，但保守性不如Lipase1中高（圖2B），10個氨基酸的保守序列的第一位為脯氨酸，不屬于保守序列模式中的典型氨基酸殘基，與大多數同源序列也不同，但與水稻（BAD09017）（圖2B）、高粱（XP_0022444703）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003572437）等植物的相應氨基酸相同。在AhLipase3中，活性位點分別位于：Ser-164、Asp-254和His-302，與其他植物同源蛋白比較表明，活性位點及其周圍的序列較保守（圖2C）。

選擇與花生3種脂肪酶同源性較高的其他植物來源的24個脂肪酶蛋白進行比較，進化樹顯示，在單子葉和雙子葉植物中均有三種脂肪酶的同源蛋白。這些蛋白明顯分為三類，其中AhLipase1與AhLipase3所在的大類親緣關系較近。AhLipase1與蓖麻和楊樹的兩個蛋白最為相似；AhLipase2與擬南芥的一個蛋白最相似，與豆科的苜蓿和大豆的兩個蛋白也較為相似；AhLipase3所在的大類中，雙子葉植物和單子葉植物中的脂肪酶明顯分為兩類，AhLipase3與苜蓿的兩種脂肪酶蛋白最相似（圖3）。 24花生脂肪酶表達分析

對花生中3種脂肪酶基因表達研究表明，AhLipase1在種子發育過程中高表達，在花生其它組織中表達量很低，在種子萌發時期的子葉中不表達；結合轉運肽預測的結果，AhLipase1可能在質體上起作用，參與三酰甘油合成與分解的動態過程。AhLipase2在種子萌發過程中高表達，在花和種子發育不同時期也有表達，在果針中有微弱表達，而在營養器官根、莖、葉中幾乎不表達。AhLipase3在各種組織中均有表達，在果針和根中的表達量相對較高（圖4）。比較花生3種脂肪酶在RNA水平的表達模式可以看出，脂肪酶參與花生生長的全過程，不同的脂肪酶分工不同，AhLipase2最有可能參與到三酰甘油的分解，為幼苗生長提供能量。

3討論

隨著基因工程的發展，近年來已有多種植物來源的脂肪酶基因被克隆。但現有的脂肪酶還不能達到工業、農業等應用的要求，克隆新的脂肪酶基因，改良其性質使其高效表達，滿足工業、農業應用的要求是脂肪酶研究的重要內容。本研究克隆的AhLipase2基因預測參與到花生種子萌發時期降解存儲的油脂，具有生物和工業研究的價值。

本研究從花生種子中克隆了3種花生脂肪酶基因，三者序列差異很大，在其他植物中也存在他們各自的同源序列，其RNA水平在不同組織中也各不相同，證明不同的脂肪酶參與到花生生長發育的各個時期。花生種子含油量高，但不耐儲藏，儲藏過程中油脂的降解使游離脂肪酸含量增高，導致酸敗使花生口味下降，影響花生油的質量。花生脂肪酶在油脂分解的第一步起作用，研究其作用機理和調控因素將為減少花生收后損失奠定理論基礎。

植物中的脂肪酸以多種形式存在，如儲藏的甘油三酯和組成細胞膜的磷脂，這些脂類分解由不同的脂肪酶完成，因此，植物中的脂肪酶組成一個大的家族，其序列上的差異決定了功能和底物的不同。本研究克隆的脂肪酶是從花生種子cDNA文庫中得到的，參與種子發育和萌發等過程，花生中可能還存在其他在種子中不表達或表達量低的脂肪酶，需要對這些脂肪酶進行全面的克隆分析，并對脂肪酶的細胞定位進行進一步的驗證，研究其底物特異性和催化特征，對其蛋白功能和酶學特性進行進一步鑒定，從而確定各個脂肪酶的功能。

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