晚期非小細胞肺癌患者鉑類藥物敏感性與ERCC1和BAG—1基因多態性的關聯性研究

[摘要] 目的 探討晚期非小細胞肺癌患者鉑類藥物敏感性與ERCC1和BAG-1基因多態性間的關聯性。 方法 隨機選取接受鉑類藥物化療的NSCLC患者100例，采用PCR-RFLP法和Logistic回歸模型檢測和分析患者ERCC1和BAG-1位點多態性及其與鉑類藥物敏感性的關聯性。 結果 ERCC1位點基因型頻率分為CC、TT和CT型分別占61.0%、7.0%和32.0%；CC型患者對鉑類藥物敏感性是T基因攜帶者的2.523倍，達到顯著（P < 0.05）；BAG-1位點基因型頻率CC、TT和CT型分別占77.0%、2.0%和21.0%，CC型患者對鉑類藥物敏感性是T基因攜帶者的2.738倍，達到顯著（P < 0.05）。 結論 ERCC1和BAG-1基因多態性可能與NSCLC患者對鉑類藥物敏感性存在關聯性，CC基因型可能對鉑類藥物較為敏感。

[關鍵詞] 晚期；非小細胞肺癌；鉑類藥物；基因多態性；ERCC1；BAG-1

[中圖分類號] R 734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）05-0065-03

肺癌是目前世界上發病率和病死率最高的惡性腫瘤，全世界每年約有150萬患者死于肺癌。晚期非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中的一種，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌，肺癌占有較大比重[1]。化療在肺癌綜合治療中占重要地位，目前臨床上標準的一線化療方案是鉑類藥物聯合三代化療新藥。雖然在臨床上鉑類藥物化療取得不錯的治療效果，但也遇到一些難以解釋的問題，如：分期和病理類型相同的NSCLC患者對同一鉑類藥物化療方案的敏感性卻差異很大，且這種差異不能用年齡及用藥等因素加以解釋[2]。近年來大量研究證實，造成化療效果差異的主要原因在于腫瘤細胞對的鉑類藥物耐藥性，其作用機制可能是決定DNA的修復能力及腫瘤細胞凋亡的相關基因位點多態性，造成了個體的腫瘤易感性和生物學行為[3]。本研究通過PCR-RFLP檢測100例接受鉑類藥物化療的NSCLC患者ERCC1和BAG-1位點多態性，旨在探討ERCC1和BAG-1位點多態性與鉑類藥物敏感性的相關性，以期為晚期NSCLC化療方案的選擇以及臨床預后的判斷提供理論參考，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

隨機選取2009年7月～2012年6月，在我院接受鉑類藥物化療的，經組織病理學確診的晚期NSCLC患者100例，均為某地漢族人。其中男54例，女46例，年齡41～82歲，平均（61.4±13.6）歲；腺癌40例，鱗癌60例；TNM分期Ⅲb期44例，Ⅳ期56例；2例，化療前患者KPS功能狀態評分70～88分，平均（76.7±4.3）分。所有患者均經CT和核磁共振等掃描證實具有可測量的腫瘤病灶，血常規、心電圖以及肝腎功能等均正常，并排除有其他惡性腫瘤病史及正接受放療等其它治療患者。化療前所有患者及其家屬均告知治療方案及簽署知情同意書，并取得醫院倫理委員會批準。

1.2研究方法

1.2.1化療方法 本研究中采用順鉑（DDP）聯合三代化療新藥的治療方案，其中50例采用DDP+TAX（紫杉醇）化療，具體方案：第2～4天，DDP 30 mg/（m2·d），第1天TAX 175 25 mg/m2，維持3 h；50例采用DDP+NVB（去甲長春花堿），第2～4天， DDP 30 （mg/m2·d），第1和第8天，NVB 25 mg/（m2·d）。各組化療以20～30 d為一個周期，2～3個周期后，對各方案化療效果進行評價。

1.2.2 療效判斷標準 療效判斷采用實體腫瘤療效評價（RECIST）標準[4]，病灶消失且持續4周判斷為完全緩解（CR）；腫瘤最大徑之和減少≥30%，并保持4周以上判斷為部分緩解（PR）；出現新病灶或基線病灶長徑總和增加≥20%判斷為疾病進展（PD）；病灶增加未到PD或縮小未達PR判斷為病灶穩定（SD）。化療有效為PR+CR，無效為PD+SD。

1.2.3 ERCC1和BAG-1基因多態性檢測 采用PCR-RFLP法檢測各基因位點的多態性。采用QIAGEN 試劑盒提取患者外周靜脈血中基因組DNA。根據ERCC1和BAG-1基因SNP位點在 NCBI中名稱，查找引物序列ERCC1（rs1052559：上游引物3’-TAGAGGAGAACCCC TACA-5’；下游引物：3’-TCTTAGGGAGGGGCCTGA-5’。BAG-1（rs11551682，上游序列：3’-GTGGTGCGAGGATGTGATGGAC-5’，下游序列為3’-CGACAAA CTGGAGACCCAC-5’。引物序列合成由上海生工合成。采用20 μL反應體系，在PCR上進行擴增，擴增程序：94℃預變性15 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸5 min，1個循環；4.0℃永久保存。ERCC1和BAG-1基因SNP位點擴增片段大小分別為204 bp和861 bp。分別采用內切酶PstⅠ和HpyCHⅢ 酶切ERCC1和BAG-1基因SNP位點擴增產物，在3.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。ERCC1擴增產物酶切后產生88 bp和116 bp兩種片段；BAG-1擴增產物酶切后產生282 bp、310 bp和592 bp三種片段。

1.3統計學處理

采用哈迪-溫伯格平衡定律（Hardy-Weinberg，HWD）檢測各基因和基因型頻率是否平恒，采用Logistic回歸模型分析各SNP位點多態性與鉑類藥物敏感性的關聯性。不同基因型間的化療療效差異顯著性采用χ2檢驗分析，當期望值<5時用Fisher精確概率法進行計算。所有統計學檢驗均為雙側概率檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義，所有計算由SPSS17.0統計學軟件完成。

2結果

2.1 鉑類藥物聯合三代化療新藥化療結果

本研究100例NSCLC患者，經3個周期化療后，CR 1例占1.0%，PR 34例占34.0%，SD 40例占40.0%和PD 25例占25.0%，總有效率為35.0%。

2.2 ERCC1基因型頻率分布及HWD檢測

ERCC1基因SNP擴增位點酶切電泳檢測結果如圖1所示。從圖1可以看出，ERCC1基因SNP擴增位點酶切后產生3種片段，分別為88 bp、116 bp和204 bp。其中純合基因型CC只有片段204 bp、純合基因型TT片段為88 bp和116 bp，雜合基因型CT有88 bp、116 bp和204 bp三個片段。在本研究中100例NSCLC患者中基因型為CC的61例占61.0%，基因型為TT的7例占7.0%，基因型為CT的32例占32.0%。對基因型頻率進行HWD檢測，χ2=0.143、1.827，P = 0.706、0.179，均符合的HWD平衡法則，吻合度檢驗良好（P > 0.05），說明研究樣本具有群體代表性。

2.3 BAG-1基因的基因型頻率分布及HWD檢測

BAG-1基因SNP擴增位點酶切電泳檢測結果如圖2所示。從圖2可以看出，BAG-1基因基因SNP擴增位點酶切后產生3種片段，分別為282 bp、310 bp和592 bp。其中純合基因型CC片段為282 bp和310 bp、純合基因型TT只有片段592 bp，雜合基因型CT有282 bp、310 bp和592 bp三個片段。在研究中100例NSCLC患者中基因型為CC的77例占77.0%，基因型為TT的2例占2.0%，基因型為CT的21例占21.0%。對基因型頻率進行HWD檢測，χ2=0.0217、1.453，P = 0.682、0.203，均符合的HWD平衡法則，吻合度檢驗良好（P > 0.05），說明研究樣本具有群體代表性。

2.4 ERCC1和BAG-1基因多態性與鉑類藥物敏感性的關聯性

ERCC1和BAG-1基因多態性與鉑類藥物敏感性的Logistic回歸分析結果見表1。結果顯示ERCC1位點CC基因型患者化療有效為21例占60.0%，與CT+TT基因型患者化療有效率比較，差異有統計學意義（P < 0.05），攜帶C等位基因患者對鉑類藥物的敏感性是T基因攜帶者對鉑類藥物敏感性的2.523倍，關聯性達到顯著水平（P < 0.05）。BAG-1位點CC基因型患者化療有效為26例，占74.28%，與CT+TT基因型患者化療有效率比較，差異有統計學意義（P < 0.05），攜帶C等位基因患者對鉑類藥物的敏感性是T基因攜帶者對鉑類藥物敏感性的2.738倍，關聯性達到顯著水平（P < 0.05）。

3討論

鉑類藥物進入NSCLC后，與DNA內部交聯形成加合物，改變DNA雙螺旋結構，導致DNA結構破壞，阻礙DNA復制。大量研究發現[5]Pt-DNA加合物濃度會隨著NSCLC細胞DNA修復能力降低而減少，從而提高NSCLC患者對鉑類藥物的療效和臨床緩解率，反之療效則差，DNA修復能力成為影響鉑類藥物化療療效的重要因素之一。

核苷酸切除修復交叉互補基因1（Excision repair cross complementing 1，ERCC1）是單鏈斷裂修復和堿基切除修復系統中的重要成分，參與鉑類藥物引起的DNA損傷修復過程。其編碼的蛋白質在DNA堿基切除修復和單鏈斷裂修復過程中都發揮重要作用。由于ERCC1多態性導致NSCLC不同個體間修復能力出現差異，從而影響對鉑類藥物的化療敏感性的分子基礎[6]。Lunn等[7]報道XRCCl該遺傳多態的色氨酸/色氨酸基因型是NSCLC的遺傳易感因素，攜帶色氨酸/色氨酸基因型患NSCLC的風險是精氨酸/精氨酸基因型的2倍。袁梵等[8]研究表明XRCC1 Ar 9194 Trp遺傳多態可能與NSCLC鉑類藥物敏感性有關。本研究利用PCR-RFLP對ERCC1 rs1052559位點進行擴增，結果ERCC1基因SNP擴增位點酶切后產生3種片段，分別為88 bp、116 bp和204 bp。其中純合基因型CC只有片段204 bp、純合基因型TT片段為88 bp和116 bp，雜合基因型CT有88 bp、116 bp和204 bp三個片段。這表明在ERCC1 rs1052559位點確實存在多態性。進一步通過對鉑類藥物敏感和非敏感的病例基因型進行分析，發現兩者CC基因型和CT+TT型間存在顯著差異，表明ERCC1 rs1052559基因型的差異表達，可能是造成對鉑類藥物敏感性差異的原因。在此基礎，我們進一步對CC基因型和CT+TT基因型與鉑類藥物敏感性的關聯性進行Logistic回歸分析，結果發現ERCC1 rs1052559位點CC型患者對鉑類藥物敏感性是T基因攜帶者的2.523倍，關聯性達到顯著（P < 0.05），這表明晚期非小細胞肺癌患者ERCC1基因多態性與鉑類藥物敏感性存在相關性。與Lunn和袁梵等研究結果一致。

Bcl-2結合抗凋亡基因1（Bcl-2 associatedathanogene 1，BAG-1）是一個新近發現的抗凋亡基因，其通過與多種靶蛋白作用而發揮抑制細胞凋亡的作用。其編碼的蛋白質氨基末端有3個α螺旋結構，可與熱休克蛋白HSC70和HSP70相互作用，并通過介導與底物蛋白發生相互作用來發揮其抑制細胞凋亡和調節轉錄等作用。BAG-1基因第7外顯子的324位點存在多態性位點，使C-T堿基轉換，導致氨基酸由蘇氨酸轉變為異亮氨酸，進而影響個體的對鉑類藥物敏感性[9]。吳倩等[10]和Sharp等[11]報道BAG-1基因在NSCLC中的表達可能與鉑類藥物的化療敏感性相關。本研究PCR-RFLP對BAG-1基因rs11551682位點進行擴增，結果ERCC1基因SNP擴增位點酶切后產生3種片段，分別為282 bp、310 bp和592 bp。其中純合基因型CC片段為282 bp和310 bp、純合基因型TT只有片段592 bp，雜合基因型CT有282 bp、310 bp和592 bp三個片段。表明在BAG-1基因rs11551682位點確實存在多態性。進一步通過對鉑類藥物敏感和非敏感的病例基因型進行分析，發現兩者CC基因型和CT+TT型間存在顯著差異，這表明BAG-1基因rs11551682基因型的差異表達，可能是造成對鉑類藥物敏感性差異的原因。在此基礎上我們進一步對CC基因型和CT+TT基因型與鉑類藥物敏感性的關聯性進行Logistic回歸分析，結果發現BAG-1位點CC型患者對鉑類藥物敏感性是T基因攜帶者的2.523倍，關聯性達到顯著（P < 0.05）。表明晚期非小細胞肺癌患者BAG-1基因多態性與鉑類藥物敏感性存在相關性。與Liu和吳倩等研究結果一致。

綜上所述，我們認為ERCC1和BAG-1基因單核苷酸多態性可能與NSCLC患者對鉑類藥物敏感性存在關聯性，C/C基因型可能對鉑類藥物較為敏感。

[參考文獻]

[1] Schiller J.H， Harrington D，Belani C.P， et al. Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small celllung cancer[J]. N Eng J. Med，2012，346：92-98.

[2] Breen D， Barlési F. The place of excision repair cross complementation 1（ERCC1） in surgically treated non-small cell lung cancer[J]. Oncol，2008，33（5）：805-811.

[3] 陳君臣，剮志良，成健，等. XPD基因單核苷酸多態性與晚期非小細胞肺癌對鉑類藥物敏感性的關系[J]. 中國老年學雜志，2011，7（31）：1114-1117.

[4] 王亞帝，成健，陳君臣，等. BAG-1基因多態性與晚期非小細胞肺癌患者鉑類藥物敏感性的關系[J]. 中國腫瘤臨床，2011，10（38）：572-575.

[5] Simon GR， Ismail-Khan R， Bepler G. Nuclear excision repair-based personalized therapy fro non-small cell cancer：from hypothesis to reality [J]. Int Biochem Cell Biol，2009，39（8）：1318-1328.

[6] 戴云，龍浩，林鵬，等. DNA損傷修復基因ERCCl和XPD遺傳多態晚期非小細胞肺癌對鉑類藥物的敏感性[J]. 中華腫瘤雜志，2010，3（28）：196-199.

[7] Lunn RM，Langlois RG，Hsieh LL，et a1. XRCC1 polymorphisms：effects on aflatoxon Bl-DNA adducts and glyeophorin A variant frequency[J]. Res，2012，59（11）：2557-2561.

[8] 袁梵，繆小平，張雪梅，等. 核苷酸切除修復系統基因遺傳多態與晚期非小細胞肺癌患者鉑類藥物敏感性關系[J]. 癌癥，2010，24（12）：1510-1513.

[9] Liu H，Liang Y，Li Y，et al. Gene silencing of BAG-1 modulates apoptotic genes and sensitizes lung cancer cell lines to cisplatin-induced apoptosis[J]. Cancer Biol Ther，2010，9（10）：832-840.

[10] 吳倩，朱志圖，哈敏文. BAG-1在非小細胞肺癌中的表達與含鉑方案化療敏感性的關系[J]. 中國腫瘤臨床，2009，36（2）：97-100

[11] Sharp A，Cutress RI，Johnson PW，et al. Short peptides derived from the BAG-1 C-terminus inhibit the interaction between BAG-1 and HSC70 and decrease breast cancer cell growth[J]. FEBS Lett，2009，583（21）：3405-3411.

（收稿日期：2012-12-04）