探究負蝗腸道菌除草活性的實驗活動

摘要：昆蟲腸道菌因其數量和種類的多樣性而成為新穎天然產物的廣泛來源，本活動通過分離與培養負蝗腸道菌，發現該腸道菌經小量液體發酵后獲得的菌液對稗草種子生長有97.3%的抑制率，在拓展學生微生物實驗技能的同時，也幫助學生探究了昆蟲和腸道菌二者的互利共生關系。

關鍵詞：負蝗 腸道菌 除草活性 種間關系

中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：B

1、引言

昆蟲腸道內棲息著的微生物不僅數量龐大，又因昆蟲的類別以及腸道結構的多樣性，其種類也特別豐富，昆蟲和腸道菌二者之間存在著廣泛、非致病的共生關系。本研究主要內容為分離負蝗腸道菌，并探究該菌株代謝產物的除草活性，是學生在學習人教版高中生物選修l“微生物的培養技術”后，對該技能的應用與拓展。此外，學生通過必修3“生物的群落”一課的學習，知曉互利共生關系作是一種重要的種間關系，但中學階段尚缺少相關適宜的探究或驗證性實驗，而中負蝗與其腸道菌之間作為共生關系的一個例證，能為高中生物教師開展探究種間共生關系的實驗活動提供參考思路。

2、實驗原理

負蝗是直翅目蝗科的一種較常見昆蟲，為農業害蟲，可在草叢以及稻、麥、高粱、玉米等作物間發現。負蝗腸道內棲息著一種叫做彎孢菌的微生物，它產生的根匍柄菌素和鄰苯二甲酸正丁異丁酯兩種化合物具有顯著的除草活性和抗真菌活性。本實驗需解剖負蝗腸道，研磨并稀釋10倍，經涂布平板法獲得腸道菌，再通過小量的液體發酵，因其發酵液中含有該腸道菌上述的兩種代謝產物，通過培養皿生物分析法便可測其除草活性。

3、實驗材料和器具

實驗材料：負蝗、稗草種子、生麥芽、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、無菌水。

實驗器具：解剖刀、鑷子、研缽、試管、搪瓷杯、三角錐瓶、紗布、濾紙片、無菌操作臺、高壓蒸汽滅菌鍋。

4、實驗方法

麥芽培養基的配置：稱量20 g的生麥芽置于搪瓷杯內，加入300 mL的水，沸煮15 min，再將汁液經紗布過濾到大燒杯中，剩余的麥芽再重復沸煮l 5 min，將兩次汁液混合，再加入20 g葡萄糖、1 g蛋白胨、15～20 g瓊脂，加水至1 000 mL。培養基及相關器皿需經高壓蒸汽滅菌鍋121℃下滅菌15 min。發酵用的麥芽培養液的配置方法相似，不加瓊脂即可，需在使用當天提前配置。

負蝗腸道菌的分離：將負蝗饑餓處理24 h后，在無菌超凈臺上操作，用體積分數為70%酒精表面消毒2 min，無菌水漂洗3次，用無菌解剖刀和無菌鑷子解剖出負蝗腸道，放在無菌研缽中加入2 mL無菌水研磨均勻，取0.2 mL稀釋液涂布于麥芽培養基平板表面，平行涂布三皿，待稀釋液充分被吸收后，在28℃恒溫箱中倒置培養3～4 d至腸道菌充分生長。

腸道菌的發酵：挑選菌株長勢良好一皿，在無菌操作臺內操作，用解剖刀在布滿腸道菌的培養板上劃上多條橫豎線，然后將培養基挖塊接種到2～3瓶裝有150 mL麥芽培養液的錐形瓶中，置于溫度為28 ℃、轉速為180 r/min的搖床中培養7 d（若沒有搖床，可以采用定時搖晃錐形瓶的方法）。將發酵液經紗布過濾后便得到含該菌株代謝產物的菌液。

除草活性實驗：采用培養皿生物分析法，取稗草種子放入含有少量蒸餾水的培養皿中，28℃的培養箱中催芽培養2～3 d至種子露白備用。取一片濾紙片放于培養皿中，加入5 mL的菌液，使濾紙片均勻浸透。然后在培養皿中放入根部露白但未有生長長度的15顆稗草種子，根部朝下放置浸潤于菌液中。平行處理3次，另取5 mL的無菌蒸餾水代替菌液重復以上步驟做空白對照。再一起置于28℃的培養箱中培養2～3 d，測定根長，求出菌液對稗草種子生長的抑制率。

5、實驗結果與討論

負蝗腸道菌株的分離結果：實驗從負蝗腸道中分離得到的菌株其菌落在28℃時的麥芽培養基上生長很快，在4 d內能都覆蓋整個平板（直徑9 am），顏色呈灰褐色或灰綠色。

除草活性實驗結果：是從對照組培養皿中隨機取出的一顆稗草種子，發現其根部長勢良好，根長為18.7 mm；從實驗組隨機取出的稗草種子，其根部未生長，仍處于剛露白的狀態。通過測量所有種子的根長，發現實驗組的45顆種子，只有少數幾顆有生長，平均每顆根長為0.7 mm，而對照組稗草種子的平均根長為19.3 mm，此次實驗中負蝗腸道菌菌液對稗草生長的抑制率為96.4%。

6、結論

已有研究表明，一些以植物為食的昆蟲其體內的腸道菌能合成一定的植物毒素，殺死植物以利于昆蟲消化。而本實驗的結果顯示，經液體發酵后負蝗腸道菌的菌液能顯著抑制稗草種子生長，抑制率達到97.3%。分析其主要原因應是文獻中所述的含有根匍柄菌素等除草活性物質，從而表明負蝗和其腸道菌確實存在著互利共生的關系。通過本實驗，學生在提高實驗操作技能和探究能力以及深入理解種間關系的同時，還能進一步思考在當今化學合成除草劑遇到研發率低且對人類生存環境帶來破壞的背景下，是否可從昆蟲腸道微生物中探尋天然除草劑的蹤跡，實現對環境的綠色無污染目標。