一道聯(lián)賽試題的啟示

在很多競賽模擬試題中出現(xiàn)：分別使用TTC和紅墨水（酸性大紅G）染色法對有活力的種子進行染色，預期的結果應該是（ ）

A.兩者都能使胚完全染色

B.前者能使胚完全染色，后者不能讓胚染色

C.兩者都不能使胚完全染色

D.后者能使胚完全染色，前者不能使胚染色

盡管此題是2010和2008年江蘇省中學生生物學聯(lián)賽初賽理論試題，但是不難看出對種子的生命力及細胞死活的鑒定在中學生物學實踐中的重要地位。為此，下面通過對種子生命力及細胞死活的鑒定方法作一些小結，以期對高中生物教學有所幫助。

細胞死活的鑒定方法有多種，高中常用的方法有：植物細胞質壁分離法，染色法。由于在直接通過形態(tài)觀察來鑒別細胞死活過程中，實驗結果易受觀察者主觀因素的影響，因此，實際操作中也常采用一些儀器來進行精確的批量檢測。另外還有“EMA-LAMP”方法等。盡管方法原理不同，但本質都是利用了死活細胞在生理機能和性質上的差異。而建立在細胞死活鑒定基礎之上的種子生命力的鑒定方法有：直接觀察法、染料（如紅墨水等）染色法、氯化三苯基四氮唑法（TIC法）、溴麝香草酚藍法（BrIB法）等。

1、細胞死活的鑒定

1.1 質壁分離法

成熟的植物細胞一般具有中央大液泡，液泡中的細胞液具有一定的溶質勢（或稱滲透勢），而活的原生質層（包括細胞膜，液泡膜及兩層膜之間的細胞質）具有半透性。當細胞與外界溶液接觸時，若外界溶液的水勢低于細胞液的溶質勢（外界溶液濃度大于細胞液濃度），則水分外滲，發(fā)生質壁分離，質壁分離的細胞與水或水勢較高的溶液接觸時，可重新吸水而出現(xiàn)質壁分離復原現(xiàn)象。當植物細胞受到嚴重傷害或已經(jīng)死亡時，不能發(fā)生質壁分離，因此常用質壁分離法來鑒定細胞的死活。

1.2 染色法

染色法分化學染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機理的不同，有的染料使死細胞著色，有的使活細胞著色。死活細胞在生理機能和性質上的差異主要包括以下幾點：

（1）死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇透過性膜，對細胞起保護和屏障作用；死細胞的細胞膜受損，通透性增加。常用臺盼藍（錐藍）染液（質量分數(shù)為0.4%）、紅墨水（酸性大紅G）或伊紅Y等染色劑鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質。它們能使死細胞著色，而活細胞不被著色。

（2）死活細胞在代謝上的差異：①美藍（又稱亞甲基藍，品藍）是一種無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞能進行新陳代謝，使細胞內具有較強的還原性，能使美藍（常用質量濃度為0.1 mg/mL）從藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此，經(jīng)美藍染色后活的酵母菌細胞無色，死細胞或代謝緩慢的老細胞，被染成藍色或淡藍色。

②熒光素雙醋酸酯（FDA）染色，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異。FDA本身不產(chǎn)生熒光，無極性，能自由穿過完整的細胞膜。當FDA進入活細胞后，被細胞內的脂酶分解，生成有極性的、能產(chǎn)生熒光的物質——熒光素，因該物質不能自由透過細胞膜而積累在細胞膜內，結果導致活細胞產(chǎn)生綠色熒光；死細胞因不能使FDA分解，而無法產(chǎn)生熒光。

（3）對細胞器染色：中性紅（3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽）是一種弱堿性pH指示劑。在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細胞能大量吸收中性紅（常用質量濃度為0.03%）并向液泡中分泌，由于細胞液在一般情況下呈酸性，進入液泡的中性紅便解離出大量陽離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色，原生質和細胞壁一般不著色。死細胞由于原生質變性凝固，細胞液外滲，因此，死的植物細胞不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象，并且中性紅的陽離子，能與帶有一定負電荷的原生質及細胞核結合，而使原生質與細胞核染色。

1.3 儀器分析法

可采用微電極技術（利用死活細胞膜兩側電位的差異）、全自動分析細胞記數(shù)儀和流式細胞儀等，對細胞的死活進行精確的批量檢測。

1.4 EMA-LAMP方法

疊氮溴乙錠（EMA）是一種只能進入死細胞并與DNA分子結合的物質。死細胞暴露于EMA僅僅1 min的時間，EMA便可以滲透細胞壁或細胞膜與其中的DNA結合，使其不能發(fā)生擴增反應（圖1）。目前，EMA與PCR、Real-time PCR等技術結合，已經(jīng)被應用于多種病原菌的檢測，以提高檢測的準確性。

2、種子生命力的鑒定

2.1 直接觀察法

植物種子中常含有黃酮類、香豆素類、酚類物質等，能夠在紫外光照射下產(chǎn)生熒光。在種子衰老或死亡過程中，熒光的顏色也相應地有所改變。由于生命力衰退或已經(jīng)死亡細胞的透性增加，當浸泡種子時，容易引起細胞內的熒光物質外滲。因此，可以通過直接觀察種胚熒光或觀察熒光物質滲出的多少來鑒定種子的生命力。

2.2 染料（如紅墨水等）染色法（方法同1.2）

2.3 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

ITC法的其原理是應用Trc的水溶液浸泡種子，使之滲入到種胚的細胞內，有活力的細胞能夠進行呼吸代謝，在呼吸代謝途中TTC作為氫受體被脫氫輔酶（NADH2或NADPH2）上的氫還原，可以將無色、質量分數(shù)為0.1%的2，3，5-三苯基氯化四唑還原為紅色、不溶性的三苯甲腙，而且細胞的生活力越強，代謝活動越旺盛，染色后紅色的程度越深。死亡的種子由于沒有呼吸作用，因而不會將TTC還原為紅色。種胚生活力衰退或部分喪失生活力，染色則會較淺或局部被染色。因此，可以根據(jù)種胚染色的部位以及染色的深淺程度來判定種子的生活力的有無與大小。

2.4 溴麝香草酚藍法（BTB法）

凡活細胞必有呼吸作用，吸收空氣中的O₂，放出CO₂。CO₂溶于水成為H₂CO₃，H₂CO₃解離成H+和HCO₃-，使得胚周圍環(huán)境的酸度增加，可用酸堿指示劑溴麝香草酚藍（BTB）來測定酸度的改變。BTB的變色范圍為pH 6.0～7.6，酸性呈黃色，堿性呈藍色，中間經(jīng)過綠色（變色點為pH7.1）。顏色變化越明顯則表明種子活力越強。死細胞沒有呼吸作用，也就沒有BTB的顏色變化。

3、啟示

細胞死活鑒定實驗是高中生物常考內容，近年來多次對此知識點的考查正在從識記與理解型向應用與實踐型轉變，因此要求生物教師要善于把相關知識點進行梳理、總結，化理論為實踐，讓生物課堂能出現(xiàn)成串的知識點，切實提高課堂教學的效果！