分光光度法測量生物組織中BPA含量

李鳳林，羅志福，鄧新榮，樊彩云，劉子華，吳 猛

(中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京 102413)

硼中子俘獲療法(boron neutron capture therapy， BNCT)是一種新型的放療方法，它是將與腫瘤有特異性親合力的10B化合物(硼攜帶劑)注入人體，經中子束局部照射使聚集在腫瘤組織中的10B與熱中子發生核反應，生成 Li與α粒子[1]。這些粒子均屬高傳能線密度(1inear energy transfer， LET)射線，具有能量高和射程短的特點，產生的α粒子能量可達1.7 MeV，平均LET為200 keV/μm ，理論上幾個α粒子釋放的能量就足以使瘤細胞致死[1]。Li與α粒子的射程分別為5 μm和10 μm (腫瘤細胞的直徑<10 μm)，因此在其射程空間內發生的電離反應可殺傷吸收硼化物的瘤細胞及與之相鄰的細胞，而對正常組織損害小。由于BNCT本身的這些特點，使得該法成為目前治療惡性腦膠質瘤最有效的方法之一[2-4]，當硼攜帶劑注入人體并在靶器官內濃聚達到一定濃度后即可開始中子照射，但為了準確給出照射劑量及照射時間，應準確測量給藥后在人體內的濃度，建立一種準確、快速測量體內BNCT藥物含量的方法對硼中子俘獲治療至關重要。

目前，生物樣品中BNCT藥物含量的測定方法主要有質譜法、原子光譜法、分光光度法、電化學分析法、放射化學分析法等[5-6]。分光光度法中比較常用的有姜黃素法、蒽醌法、甲亞胺-H法等。質譜法、原子光譜法測量準確度、靈敏度高，但樣品前處理復雜，記憶效應嚴重且儀器設備昂貴；放射化學法因涉及放射性限制了其應用范圍；分光光度法中姜黃素法需無水狀態，蒽醌法需大量的濃硫酸，使得測量操作存在一定的危險[7-9]。隨著新型的硼顯色劑3-甲氧基-甲亞胺-H的研制成功[10-13]，提高了分光光度法的靈敏度和檢測限，該方法儀器設備簡單、易操作，是一種可準確、簡便、快速測定生物體內BNCT藥物含量的方法。

本研究擬建立以3-甲氧基-甲亞胺-H 為顯色劑測量BNCT藥物含量的分光光度測量方法[9-13]，并用于給藥后動物體內二羥基硼酰苯丙氨酸(P-Boronophenylalanine，BPA)濃度的測量，研究在正常小鼠體內的生物分布，以確定BPA的靶向性和有效性。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

D(+)-果糖：比利時ACROS公司；3-甲氧基-甲亞胺-H：上海金圣化工有限公司產品；鹽酸、氫氧化鈉、氨水、乙酸、乙酸胺、EDTA、濃硝酸、抗壞血酸、鈉(≥99.5%)等：北京化學試劑公司產品；BPA：本實驗室合成。

1.2 實驗儀器

移液器(100～1 000 μL)：瑞士Socorex；移液器(1～5 mL)：芬蘭Finnpipette；211型pH計：Orion Research；UV2450型紫外-可見分光光度計：日本導津；TGL-16L型離心機：上海安亭科學儀器廠；AR2130電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)；手術器械、一次性無菌注射器等：北京大學醫學部提供。

1.3 實驗動物

正常昆明小鼠：體重18～22 g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 溶液配置

(1)EDTA溶液(2%)：稱取1.0 g EDTA, 加40 mL蒸餾水加熱溶解，用4 mol/L NaOH溶液調節pH至8，定容至50 mL。

(2)乙酸-乙酸胺緩沖溶液： 稱取100.0 g乙酸胺溶于400 mL蒸餾水中，并加入冰醋酸28 mL調節溶液pH為5.7±0.2，加水定容至500 mL。

(3)3-甲氧基-甲亞胺H溶液： 稱取0.27 g 3-甲氧基-甲亞胺-H，用0.5 mol/L NaOH溶液完全溶解，再加入0.6 g抗壞血酸，用HCl調節pH為5.7±0.2，定容至30 mL，于聚丙烯瓶中保存。

(4)BPA-果糖(BPA-F)溶液配制：150.0 mg BPA加143.0 mg果糖，用適量水溶解，并用4 mol/L的NaOH溶液調節pH至9.5～10.0 之間，再用3 mol/L的HCl調節pH至7.4，加水定容至5 mL，則此溶液BPA濃度為30 g/L(0.14 mol/L)。

2.2 生物樣品處理

血清0.15 mL加50 μL水潤濕，加0.5 mL濃硝酸消解12 h，再加0.2 mL H2O2繼續消解，待無氣泡產生時，置于加熱塊上于100 ℃加熱至溶液近干，待測。組織先充分碾碎勻漿，然后稱取質量不大于0.1 g的樣品，與血清同樣方法進行消解。

2.3 分光光度法的建立

2.3.1最大吸收波長的確定

取濃度為25 mg/L的BPA溶液0.2 mL于帶刻度聚丙烯管中，加入EDTA溶液0.5 mL，乙酸-乙酸胺緩沖溶液1 mL，再加入顯色劑溶液1 mL，加水定容至5 mL，搖勻放置40 min，以不加顯色劑的混合溶液為空白對照，在200～600 nm波長下進行紫外-可見光掃描，確定最大吸收波長。以蒸餾水為空白，按上述方法配制不加BPA溶液的顯色劑及其他試劑的混合溶液，在200～600 nm波長下進行紫外-可見光掃描，以確定在所選最大波長處顯色劑及其他試劑對顯色的影響。

2.3.2影響因素

(1)pH影響

按常用緩沖液配制方法配制pH分別為4.5、5.0、6.5的乙酸-乙酸胺緩沖液，然后用乙酸調節pH分別為4.0、5.5、6.0的緩沖溶液，按前述方法，在2.0 mg/L硼元素條件下，依次配制pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的待測液，于最大吸收波長處測吸光度，以考察溶液pH對顯色的影響。

(2)顯色劑用量的影響

按前述方法，在硼元素濃度為2.0 mg/L的條件下，改變顯色劑用量：0.2～1.6 mL，考察顯色劑用量對測定的影響。

(3)反應時間的影響

按前述方法，配制含硼元素2.0 mg/L的待測液，加入顯色劑后，立即開始反應動力學測定，時間為0～2 h。

(4)標準曲線制備

按BPA-F溶液的配制方法配制6 mL BPA-F溶液，使其BPA濃度為3.344 g/L，依次倍比稀釋成BPA濃度為1 672 、836、418、209、104.5 mg/L的系列溶液。依次吸取上述溶液0.1 mL分別置于6個離心管中，另取一管加果糖溶液做空白，再依次加入0.15 mL血清，充分混勻，按2.2節方法消解后，依次加入EDTA溶液0.25 mL，乙酸-乙酸胺緩沖溶液0.5 mL，3-甲氧基-甲亞胺-H溶液0.5 mL，加水稀釋至2.5 mL，則其硼元素濃度依次為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0 mg/L，反應40 min后，于最大吸收波長處測定吸光度。

2.3.3準確度

(1)血清中加BPA

吸取血清0.15 mL，加入高、中、低三個不同濃度的BPA溶液0.1 mL，使得每個濃度的樣品中含BPA分別為5.0、10.0、20.0 μg，每個濃度平行做三個樣品，另取一份血清不加BPA做空白，混勻，按照2.2節方法消解，按配制標準曲線溶液的方法配制待測液，測定吸光度。

(2)小鼠組織中加BPA

取三只小鼠，分別取其肝、肺、腎、腦、頭皮，碾碎勻漿后，每個臟器稱取質量相同(質量均小于0.1 g)的兩份，一份加入0.1 mL BPA溶液(每份平行做三個樣品)，使得每個樣品中含BPA 20.0 μg，另一份不加BPA做空白，按照2.2節方法消解，按配制標準曲線溶液的方法配制待測液，測定吸光度。

2.3.4精密度

按準確度實驗中所述方法，在血清中加BPA溶液，消解后分別配制硼元素含量為0.5 mg/L和5.0 mg/L的待測樣品各6份，進行6次平行測定。

對工程材料進行成本控制，首先要對工程材料的選購進行控制。選購施工材料前，應對施工需要的工程材料的種類和數量進行規劃，以避免材料浪費導致成本增加。同時，根據工程的具體位置以及施工現場周邊的環境等因素，確定料場的位置和面積。在選擇料場位置時，要盡量選擇離攤鋪現場較近，并且在整個施工標段的中間位置，從而減少工程材料的運輸距離、運輸等待時間及運輸費用，提高工程材料的運輸效率，最終節省運輸成本。因此，通過實際使用的施工設備的數量、工程材料的種類、材料的存儲情況等情況，對工程材料進行科學、有效、系統的前期規劃。

2.3.5檢測限

按配置標準曲線的方法依次配置硼濃度分別為0.25、0.012 5、0.062 5、0.031 25 mg/L的待測液，于最大波長處測定吸光度，在儀器靈敏度范圍內，以扣除空白值后吸光度為0.01時相對應的濃度為檢測限L。

2.4 分光光度法與ICP-MS方法的對比

取注射過BPA-F的小鼠組織勻漿物，消解后分別吸取0.15 mL，每一個樣品同時制作兩份，一份按上述分光光度法進行測量，另一份直接用4%硝酸溶液稀釋至5 mL，0.22 μm膜過濾后用ICP-MS方法測定，比較兩種方法所測結果的差異性。

2.5 正常小鼠體內BPA生物分布

取BPA-F溶液5 mL，昆明小鼠24只，隨機分為6組，每組4只，其中一組為空白組，不注射BPA，其余5組小鼠尾靜脈注射BPA-F溶液100 μL，分別于5、30、60、120、180 min摘除眼球取血，頸椎脫位法處死，取出心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、頭皮。各組織充分碾碎勻漿后，稱取0.1 g于聚丙烯瓶中，血液量取0.15 mL，按前述生物樣品處理方法處理后，用建立的分光光度法測量各組織中的BPA含量，計算單位質量組織中攝取的BPA量，所得結果進行統計學分析。

3 結果與討論

3.1 BPA最大吸收波長

BPA顯色后，在200～600 nm掃描結果示于圖1。由圖1可見，BPA顯色后在400 nm處有最大吸收，而顯色劑與其他試劑在此處吸收甚小，故選此波長作為檢測波長。

圖1 最大吸收波長掃描圖Fig.1 The scanning result of the maxmium absorbing wavelength

3.2 BPA標準曲線

將測得的吸光度與濃度進行回歸，結果示于圖2。結果表明，硼濃度在0.2～6.4 mg/L范圍內，線性良好，R為0.999 6。

圖2 BPA標準曲線Fig.2 The standard curve of the BPA

3.3 影響因素

(1)pH的影響

由圖3可得pH為4～6.5的溶液中，硼與顯色劑反應后吸光度基本保持不變，顯色穩定，在該范圍內溶液pH對顯色無影響。

圖3 pH的影響Fig.3 The effect of pH

(2)顯色劑用量

顯色劑用量影響示于圖4，由圖4可見，顯色劑加入量為0.8～1.6 mL時，吸光度可達最大且穩定，但因顯色劑本身有顏色，且吸光度隨其體積的增大而增大，故本實驗最終選擇顯色劑用量為1.0 mL。

圖4 顯色劑用量影響Fig.4 The effect of the amount of the chromogenic reagen

(3)反應時間的影響

反應時間的影響示于圖5，由圖5可見，加入顯色劑反應40 min后達到最大吸光度，且2 h內保持不變，因此選擇反應40 min后進行測量。

圖5 反應時間的影響Fig.5 The effect of the reaction time

3.4 準確度

(1)血清中加BPA

血清中BPA回收率結果列于表1，由表1可知，回收率在98.17%～100.94%，平均回收率為99.6%，相對標準偏差<2%，回收率較好，測量準確。

(2)鼠組織中加BPA

小鼠組織中回收率結果列于表2，由表2可見，小鼠組織中的平均回收率為92.9%，相對標準偏差<6%，回收率較好。

3.5 精密度

精密度結果列于表3，由表3可見，通過對兩個濃度各6個樣品的6次平行測定，相對標準偏差均<2%，表明該方法的精密度良好。

表1 血清中BPA回收率

表2 小鼠組織中BPA回收率

表3 精密度

3.6 檢測限

通過測量不同濃度待測液的吸光度得到當待測液含BPA濃度為0.044 mg/L時，溶液的吸光度為0.01，因此確定該方法的檢測限為0.044 mg/L。

3.7 分光光度法與ICP-MS方法的對比

兩種方法測定結果比較列于表4，由表4可見，對6個生物樣品分別用分光光度法和ICP-MS法進行BPA含量測定，兩種方法無顯著性差異(t=2.01，P>0.05)，BPA濃度分光光度測量方法準確、可靠。

3.8 BPA生物分布

給藥后，小鼠體內主要器官的單位質量組織中的BPA濃度列于表5。由表5可見，尾靜脈注射BPA后，各器官在注射后30 min達到最大攝取，血、腎、腸、頭皮中攝取較高，在血液中清除較快；腎中分布較高，表明BPA主要通過泌尿系統排泄；頭皮中含量較高，表明靶向性較好。以上結果與文獻報道吻合[14-15]。

表4 兩種方法測定結果比較

表5 BPA在正常小鼠體內生物分布(x±s，n=4)

4 結論

本研究建立了BNCT藥物分光光度測量方法，并將該法對生物樣品內BPA濃度的測量結果與 ICP-MS方法測量的結果進行了比較，結果顯示兩種方法無顯著性差異，實現了用簡單儀器、快速、準確地測定生物體內BPA含量的目的，為BPA的進一步實驗研究提供了依據和條件，并為其他BNCT藥物的研發提供了有效的測量方法。BPA在動物體內的生物分布結果表明其靶向性良好，預期對腦膠質瘤的治療會有良好效果。

致謝:

感謝各級領導對本工作的大力支持，感謝原子高科股份有限公司葉肇云老師及放射化學研究所各位老師的指導幫助，感謝項目組同事的熱情幫助。

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