10個桉樹無性系抗寒鍛煉特性的研究

洪 偉 趙娟娟 林 晗 吳承禎*，3

（1.福建農林大學 桉樹研究中心，福建 福州 350002；2.中國科學院 城市環境研究所，福建 廈門 361021；3.武夷學院，福建 武夷山 354300）

抗寒鍛煉即冷適應（cold acclimation），是植物在低溫作用下，抗寒力提高的過程，實質上是植物感受低溫信號、調節基因的表達和代謝的環境適應過程。當氣溫回暖時，由抗寒鍛煉獲得的抗寒力會重新喪失，這個過程稱為解除鍛煉或脫鍛煉（cold－dehardening）。植物抗寒鍛煉的分子機理可以概括為低溫誘導基因的表達調控，調控的水平分別為轉錄前、轉錄和轉錄后，其中轉錄前調控包括對低溫等環境信號的感受和傳導[1]。抗寒鍛煉能誘導植物抗凍基因的表達使植物的抗凍性增強，因此對抗凍性的研究離不開對抗寒鍛煉的研究。不同品種或變種，其抗寒鍛煉誘導抗凍性的能力不同。不同桉樹樹種也具有不同的抗寒鍛煉能力，Dugald M.Paton[2]對桉樹的研究顯示，5種桉樹對0.5℃鍛煉溫度的反應明顯不同。

電導法被普遍用于植物抗凍性的研究和抗寒品種的篩選[3]。電導法作為比較基因型間抗凍性差異的細胞生態學指標是可行的[3～6]，國內外有大量關于桉樹及其他植物的抗凍性研究都表明，電解質滲透率作為細胞膜傷害程度的指標，與凍害水平間具有很好的相關性；電解質滲透率配合Logistic方程對桉樹的凍害發展過程作出凍害曲線，擬合出的LT50能很好的反映植物的凍害存活率[4]。Raymond等[5]對 E.regnans一個全同胞家系用電導法識別出一個抗霜凍的非加性遺傳組分。Byrne M.等[6]用電導法測定亮果桉抗凍性，結合其他QTL分析方法，定位了抗霜凍的2個QTL位點。我國引種桉樹（eucalyptus）盡管有上百年的歷史，但不同桉樹無性系的抗寒鍛煉特性研究未見報道，尤其以冷庫為平臺探討抗寒鍛煉、脫鍛煉及苗齡處理對桉樹膜傷害影響國內外鮮見報道。本研究以10個桉樹無性系為對象，以大型冷庫為平臺，通過電導率評價抗寒鍛煉、脫鍛煉對桉樹無性系的影響，對區別桉樹基礎抗凍能力與冷鍛煉能力、評價桉樹抗凍性具有重要理論價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇10個桉樹無性系作為實驗材料，依次編碼為XL1～XL10。實驗材料為組培苗，每個無性系30株，經2個月的培育，苗高及葉量達到要求后，于2005年9～10月進行抗寒鍛煉、脫鍛煉及凍害脅迫處理。

1.2 實驗設計

1.2.1 抗寒鍛煉與脫鍛煉處理法

每個無性系取生長一致的幼苗各18株。其中CK0處理和CK對照各3株，培育于常溫下的苗圃中。其余植株作為處理株進入冷庫進行抗寒鍛煉與脫鍛煉的實驗。每個處理設3個重復。

整個處理過程以抗寒鍛煉情況為準分為6種處理。處理1：實驗開始前常溫下正常生長的植株，記為CK0處理；處理2：實驗全部結束后的對照株（實驗日期共 32.5d），記為 CK 對照；處理 3：6℃恒溫處理 10d后的處理株，記為 CH1（cold－hardening）處理；處理 4：處理3的基礎上再經3℃恒溫處理10d的處理株，記為CH2處理；處理5：處理4的基礎上再經0℃恒溫處理10d的處理株，記為CH3處理；處理6：處理5的基礎上再經脫鍛煉處理的處理株，記為DH（De－hardening）處理。脫鍛煉處理為5℃～25℃逐漸升溫處理，即5℃、10℃、15℃、20℃、25℃依次各 12h的處理。

1.2.2 凍害脅迫處理方法

鍛煉和脫鍛煉后進行凍害脅迫，凍害脅迫時間為當天 8:00～16:00，實驗株轉入冷庫后于 8:00、10:00、12:00、14:00 和 16:00 時分別將溫度調為－2℃、－4℃、－6℃、－8℃、關機；降溫速度為 5℃/min，每個溫度處停留2h，于16:00時脅迫處理完畢。每階段低溫脅迫處理結束后，分別對處理株采集葉片并測定電解質滲透率。

以上鍛煉、脫鍛煉及凍害處理實驗均在福建農林大學福建省農副產品保鮮技術工程中心自制的冷庫（共1～8號庫）內進行。該冷庫的實驗條件為，光照時間每日8:00～17:00，光照強度150W/m2，光源為白熾燈；水分條件：土壤保持濕潤，空氣濕度為80～100%。實驗期間不進行施肥或施藥處理。

1.3 半致死溫度的測定

1.3.1 電導率測定

零下低溫脅迫處理中，于當天的8:00、10:00、12:00、14:00及16:00共5個整點時間分別對處理株順序采集+3～+7葉位的葉片，作為零下低溫脅迫各階段的處理樣品測定其電解質滲透率的變化情況[3～6]。樣品經充分沖洗后再經單蒸水潤洗，然后用1cm直徑的打孔器分別從每份樣品葉中隨機打取10個小圓葉片 （避開葉脈及葉緣），放入10ml離心管中，加雙蒸水8ml，真空滲入3h，每隔1h取出離心管振蕩一次。待葉片下沉后，靜置10min，測定處理電導值B；后置沸水浴中10min，冷卻后測煮后電導值C。并依下式計算電解質滲透率[3～6]：

1.3.2 半致死溫度計算

根據電解質滲透率進行回歸分析，得到logistic方程（y=k/(1+ea－rt)），求得 y=k/2 時的 t值（溫度）作為桉樹凍害脅迫的半致死溫度[3～6]。采用電解質滲漏達到50%的低溫點作為植物的半致死溫度，即在“溫度－相對電導率”的S型曲線上表現為曲線的拐點所對應的溫度，以直觀、準確地反映植物的抗寒能力[7]。

1.4 數據處理

數據分析均采用Spss10.0與Excel 2000處理完成，Logistic曲線的擬合和拐點溫度的求解由自編的Qbasic程序計算。

2 結果與分析

2.1 抗寒鍛煉處理半致死溫度的差異顯著性分析

分析測定10個無性系各6種處理的電解質滲透率，獲得半致死溫度及曲線擬和R2值（表1）。對不同桉樹無性系半致死溫度進行方差分析，表明6個處理間的差異性達到極顯著水平（p＜0.05），但是不同無性系間未達到顯著水平（p＞0.05）。表明，半致死溫度可用于比較6種不同處理的抗凍性差異，但不適于區別不同桉樹無性系間抗凍性的差異。盡管不同樹種間的抗凍性差異一般較明顯，但樹種不同無性系間的抗凍性差異比樹種間的差異小得多。

表1 10個桉樹無性系的半致死溫度（LT50，單位℃）Table 1 The temperatures for 50%survival rate of eucalypt clones(LT50，unit℃)

對10個桉樹無性系6個處理的半致死溫度進行配對T檢驗（表2），表明3種鍛煉處理中只有CH2鍛煉處理與CK對照處理的差異性達到極顯著水平，而CH1、CH3鍛煉處理與CK對照處理的差異均不顯著，即3個鍛煉處理水平中以CH2處理增強桉樹無性系抗凍性的效果最好。但DH脫鍛煉處理與CK對照處理的差異不顯著，因此CH2鍛煉處理所獲得的抗凍性經脫鍛煉處理后將消失。3個鍛煉處理中，CH2與CH1、CH32個鍛煉處理之間的差異性均達到極顯著或顯著水平，但CH1、CH3之間的差異性不顯著，進一步說明CH2抗寒鍛煉處理明顯比CH1、CH32種抗寒鍛煉處理更能提高桉樹的抗凍性。

2.2 抗寒鍛煉對桉樹無性系抗凍性的影響

研究表明抗寒鍛煉可以增強大部分桉樹無性系的抗凍性，但是不同無性系對相同抗寒鍛煉處理的反映明顯不同（圖1），這與Dugald M.P.[2]的研究規律相一致。DH處理使大部分無性系的抗凍性重新降低，但是XL5和XL10的半致死溫度非但沒有上升反而下降，可見這2個無性系在0℃脅迫下抗凍性上升 （圖1），因此該脫鍛煉處理雖然使大部分無性系達到脫鍛煉的效果，但是還有部分無性系未脫鍛煉。

表2 不同低溫處理間半致死溫度的配對T檢驗結果Table 2 Paired-samples T test results of LT50 in different chilling treatments

總體而言，LT50反映的不同低溫處理對桉樹無性系的抗凍性影響規律較為復雜，CH2鍛煉處理使大部分無性系的抗凍性大幅上升 （如 XL1、XL2、XL5、XL6、XL8、XL10），但也使一些無性系的抗凍性降低 （如XL4）。CH1和CH3鍛煉處理對大部分桉樹無性系的抗凍性沒有正面的影響，而是使其抗凍性大幅降低，或者不影響其抗凍性。苗齡相差1個月的苗齡處理，比苗齡更大的那組對照株抗凍性降低。

Li[8]將馬鈴薯抗凍基因型分為RA（冷抗可鍛煉型）、RUA （冷抗不可鍛煉型）、SA （冷敏可鍛煉型）、SUA（冷敏不可鍛煉型）4種類型，并推測植物的基礎抗凍性與鍛煉能力具有不同的遺傳機理。郭玉華等[9]的研究也支持此觀點，其用存活率和離子滲透率檢測法測定了18個小麥品種，結果表明，離子滲透率檢測分辨率最高的溫度是-10℃，抗寒性強的品種有不同的抗寒機制，基礎抗凍能力與冷鍛煉能力對最終抗凍性的貢獻有很大差別。本文的實驗結果支持相同的結論和推測。

2.3 桉樹無性系處理間半致死溫度差值的變化規律

將鍛煉、脫鍛煉、未鍛煉3種不同處理的半致死溫度相減，以比較處理間的差異（表3）。以所得差值作為不同處理桉樹無性系間抗凍性的差異水平，對不同處理間的抗凍性水平進行比較分析。其中“CK-CK0”是常溫下正常生長株在實驗結束后1d（CK）與實驗前1d（CK0）2個時間點間的半致死溫度差值，代表常溫下正常生長株經過1個月的生長之后半致死溫度的變化情況。由于CH2鍛煉處理、CH3鍛煉處理與DH脫鍛煉處理的處理時間分別為20d、30d和32.5d，所以其生長引起的抗寒性與CK相似，選用CK對照與CH2、CH3和 DH 進行比較，“CH2-CK ”、“CH3-CH2”和“DHCK”分別代表二者間的半致死溫度差值，是剔除生長因素的影響后CH2、CH3鍛煉處理和DH脫鍛煉處理對桉樹半致死溫度的影響情況。同理，由于CH1鍛煉處理為10d，所以其生長引起的抗寒性與CK0相似，借用與CK一樣未做低溫處理的CK0處理（苗齡處理）與CH1進行比較。“CH1-CK0”即二者間的半致死溫度差值，代表剔除生長因素的影響后CH1鍛煉處理對半致死溫度的影響情況。

由于10個無性系的對照株在實驗期前、后的半致死溫度差值全部為負值，可知半致死溫度即抗凍性隨著苗齡的增加而上升（表3）。CH2鍛煉處理使無性系的抗凍性明顯增強，平均使各無性系的半致死溫度降低了4.95℃。CH1和CH3鍛煉處理可以增強某些無性系的抗凍性，但是效果不明顯。CH1鍛煉處理使無性系的半致死溫度平均下降了0.013℃，CH3處理使半致死溫度平均下降了0.128℃。進一步證明，大部分無性系以CH2抗寒鍛煉處理（即6℃10d+3℃10d）增強抗凍性的效果最佳（表3）。

表3 不同鍛煉處理與對照處理的半致死溫度差值表Table 3 Deviation values between chilling treatment and CK

2.4 桉樹無性系抗寒鍛煉特性與抗凍性機理分析

根據郭玉華等[9]的方法，這里也將抗寒鍛煉前與抗寒鍛煉后桉樹無性系的半致死溫度進行排序并分別聚為3類。應用SPSS10.0對抗寒鍛煉前或未鍛煉（CK0）10個桉樹無性系的半致死溫度值（表 4），進行K-均值聚類分析，其中1類的聚類中心為-4.37、2類的聚類中心為-2.31、3類的聚類中心為0.41（表4）。經計算抗寒鍛煉處理后各無性系抗凍性的最大增強值即CH1-CK0、CH2-CK和CH3-CK中的最小值 （即LT50降低的最大值），可進行增強值大小的排序和聚類分析（表4），其中1類的聚類中心為-8.54、2類的聚類中心為-4.96、3類的聚類中心為0.90。

基于冷抗與冷敏性，比較各無性系在鍛煉前的半致死溫度及抗寒鍛煉引起的抗凍性增加值 （表4）和CH3鍛煉引起的抗凍性增強值（表3），表明鍛煉前抗凍性聚類（CK0）為“1”的作為10個無性系中的冷抗無性系，聚類為“3”的作為冷敏無性系；鍛煉后ΔLT50聚類為“1”的是鍛煉性強的無性系，為“3”的是鍛煉性弱的無性系；聚類為“2”的均為中間型的無性系。

根據鍛煉后的maxΔLT50與鍛煉前的CK0對不同無性系的抗凍性機理進行分析，XL4的CK0為“1”類，而其maxΔLT50為“3”類，所以XL4屬于冷抗不可鍛煉無性系；XL7的 CK0為“2”類，而其 maxΔLT50為“3”類，所以是中性抗冷不可鍛煉的無性系；XL5、XL8、XL9和XL10均為可鍛煉的無性系，maxΔLT50都為 “1”類，除XL10為冷敏可鍛煉無性系外其他無性系為中性抗凍可鍛煉無性系；其它4個無性系均為中等可鍛煉的無性系，其中XL1、XL3為中性抗凍中等可鍛煉無性系，而XL2和XL6為冷抗可鍛煉無性系。

表4 CK0處理桉樹無性系LT50與抗寒鍛煉后桉樹無性系maxΔLT50的聚類分析Table 4 Results of cluster analyses for the maxΔLT50 after chilling treatments functioning as cold-hardening processes and LT50 of SA treatment of eucalypt clones

3 結論與討論

研究10個桉樹無性系苗齡相差1個月的2種未鍛煉植株在凍害脅迫后半致死溫度的變化情況，發現所有無性系的抗凍性均在1個月后有所增強，半致死溫度平均降低了1.08℃，以苗齡更大的那組未鍛煉處理的抗凍性較高。而且不同的桉樹無性系根據半致死溫度進行抗凍性排序的結果，在1個月的生長期后有較大的變化?？梢婅駱洳煌瑹o性系的抗凍性會隨著苗齡的增長而變化，并且變化的幅度和抗凍性排序的結果都有變化。本實驗選用苗齡相同的無性系進行抗寒鍛煉性研究，并設置了1個苗齡處理比較生長與抗寒鍛煉對抗凍性的影響，在抗寒鍛煉的分析過程中剔除生長對抗凍性的影響進行分析，使抗凍性評價和抗寒鍛煉性分析的準確性大大提高。

半致死溫度計算結果表明，6個處理之間的差異性達到極顯著水平，但是不同無性系間半致死溫度的差異未達到顯著水平，所以半致死溫度用以比較不同處理的抗凍性差異是適宜的。不同低溫處理對桉樹無性系的抗凍性影響規律較為復雜。大多數的桉樹無性系在6℃10d+3℃10d的CH2鍛煉處理后，抗凍性比未鍛煉的對照株有大幅度增強，半致死溫度平均降低了4.95℃；但是也有一些無性系的抗凍性降低。CH1和CH3鍛煉處理對大部分桉樹無性系的抗凍性沒有正面的影響，而是使其抗凍性大幅降低，或者不影響其抗凍性。脫鍛煉處理對桉樹無性系的抗凍性恢復能力也有不同。根據鍛煉后的maxΔLT50與鍛煉前的CK0對桉樹不同無性系的抗凍性，借鑒Li[8]對抗凍性基因型劃分的4種類型，認為XL4屬于冷抗不可鍛煉無性系、XL7屬冷敏不可鍛煉的無性系，XL2和XL6為冷抗可鍛煉無性系；其它6個無性系為冷敏可鍛煉無性系（ 其中 XL5、XL8、XL9屬中性抗凍可鍛煉無性系，XL10屬冷敏可鍛煉無性系，XL1、XL3屬中性抗凍中等可鍛煉無性系）。

植物抗凍性與其抗寒鍛煉性有很大的關系，這種抗寒鍛煉程度在自然界表現為零下低溫凍害前零上低溫的溫度和持續時間，因此不同地區不同氣候下形成的抗寒鍛煉條件是不同的。Dugald M.P.[2]研究表明，熱帶種棉芝老桉（Eucalyptus.deglupta）不能響應低溫鍛煉，不管它鍛煉時間多長，在-8℃冰凍下所有植株都死亡；而多枝桉 （Eucalyptus.viminalis）和稀花桉（Eucalyptus.Pouciflora）經 4～5d鍛煉后有半數以上的植株足以忍耐-8℃冰凍并且無傷害，這2種桉樹的最大抗凍力分別產生于鍛煉后10d和20d，且稀花桉的抗性比多枝桉大得多；其余幾種桉樹的鍛煉啟始速率及最終達到的抗凍水平介于稀花桉和棉枝老桉之間。因此，樹種抗寒性鍛煉，其抗凍性差異較大，本研究也表明抗寒性處理不同桉樹抗凍性排序不一樣。同理，桉樹抗寒鍛煉受體生長期不一樣，其抗凍性排序也將變化。因此桉樹抗寒無性系的篩選應該選用什么實驗材料、如何進行抗寒性實驗才能較好地反映成年桉樹無性系的抗凍性還有待進一步探討。

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