UV-B輻射對小麥葉片蛋白的影響

齊婷婷 段江燕

（山西師范大學生命科學學院，臨汾 041000）

由于近20年全球平均臭氧層減少了2%-3%［1］，從而導致到達地表的太陽紫外輻射（UV-B）增強，影響了地球上動植物以及人類本身。有關UV-B輻射對植物的影響，國內外學者已研究了大約400種植物的相應變化反應［2］。

小麥作為我國北方重要的糧食作物之一，許多學者關注了UV-B輻射對它的影響［3］，何麗蓮等［4］研究了10個小麥品種對UV-B輻射增強響應的生長和產量差異。馬曉麗等［5］對小麥經UV-B輻射和He-Ne激光修復后其葉片蛋白和核酸含量等變化進行了研究。黃修文等［6］對UV-B輻射處理過的小麥幼苗期葉片的蛋白質組進行了分析。李元等［7，8］研

究了不同生長時期小麥的生長變化，陳建軍等［9］集中于研究小麥某個品種的特定時期或者不同品種小麥的特定時期的生長變化，而對于小麥幼苗經受不同天數UV-B輻射后的生長變化和自我修復過程及差異蛋白的研究很少。因此本研究對不同天數UV-B輻射下小麥葉片生長指標的變化過程進行初步研究和分析，以明確植物對不同天數UV-B輻射后的適應性反應及其自我修復生長過程。

1 材料與方法

1.1 材料

紫外B 組發生用紫外-B 燈（秦牌，寶雞制造，8 W，297 nm）模擬增強UV-B 輻射，將其垂直懸于培養皿的上方，通過調整UV-B燈與植物之間的距離來控制UV-B 輻射的強度，輻射強度0.82 W/m2，照射20 min，UV-B 劑量約為1 KJ/m2· d 。采用紫外輻照計（UV-B 型，北師大光電儀器廠）對UV-B 輻射功率密度進行測定，儀器預先用742 型輻射強度測定儀（FL，USA）進行校正。

晉麥47號（Triticum aestivum，jinmai47）由山西省農業科學院小麥研究所提供。 選取籽粒飽滿，大小均一，生活力較好的小麥幼苗，培養于盛有濕濾紙的培養皿內，30粒/盤，每組3次重復，25℃恒溫培養箱中培養。種子露白時待處理。共設對照（CK）、UV-B處理（B）2組（表1）。

表1 各處理組的設置及處理程序

1.2 方法

1.2.1 葉片指標測定 小麥處理3 d后，每隔1 d按常規法對葉片長度進行測量并求其平均值、稱其葉片重量、用ADC便攜式葉面積儀測培養皿內每片葉面積并計算出平均葉面積。

1.2.2 葉片總蛋白含量測定 取0.2 g粉末溶于1.5 mL蛋白質提取液，攪動30 s，離心（12 000×g，4℃，15 min），取上清夜再重復離心，收集上清；加3倍體積冷丙酮，-20℃放置過夜；離心（12 000×g，4℃，15 min）。收集沉淀，揮發去丙酮，用樣品裂解液裂解。蛋白濃度定量參照Bradford（1976）方法建立標準曲線和測定樣品的蛋白濃度。

1.2.3 葉片聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 選取具有代表性的UV-B輻射天數，提取小麥葉片總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用凝膠分析軟件進行分析。

1.2.4 雙向電泳 蛋白質含量約300 μg的蛋白質提取液，按1∶4的比例加入水化上樣液；聚焦盤中加入樣品混合液200 μL；去除保護膜的預制7 cm IPG膠條，主動水化16 h，兩次1 h的除鹽，20 000伏小時（Vh）聚焦。第二向SDS-PAGE：等電聚焦后的膠條于平衡緩沖液I、平衡緩沖液Ⅱ中先后平衡15 min。平衡后的IPG膠條轉移至聚丙烯酰胺凝膠上，與之緊密接觸，并用低熔點瓊脂糖進行封膠。起始電壓為50 V，膠條之下電壓加大到120 V。凝膠固定30 min，染色12 h，脫色液脫色2 h。凝膠用UNAX Power look 2100XL-USB 彩色掃描儀進行掃描，并用PDQuest軟件進行分析。

1.2.5 膠內酶切與質譜鑒定 從凝膠上選取鑒定的蛋白質點，挖取后轉入PCR管中，重復兩次脫色20 min（50%乙腈+50 mmol/L碳酸氫銨），脫水10 min（100%乙腈），烘干后的膠在4℃trypsin酶溶液中酶解30 min；37℃烘箱中酶解過夜；50%乙腈+0.1%TFA 60 μL，30 min后將溶液轉移至新的96孔板內。樣品用4700串聯飛行時間質譜儀4700 Proteomica Analyzer進行質譜分析。

1.3 統計分析

測試各指標3次，取其平均值，用 Excel進行折線圖繪制。

2 結果

2.1 增強UV-B輻射對小麥葉片的影響

經不同天數的UV-B輻射后，小麥葉片平均長度、總重量、平均葉面積都發生了顯著的變化，生長到第3-5天時，B組小麥各指標值均大于CK組小麥，且第4天的差異較大；小麥生長至第6-7天時，B組小麥與CK組小麥各指標值相差甚??；小麥生長至第8-9天CK組小麥各指標值大于B組小麥，且第8天差距較大（圖1-圖3）。

圖1 不同天數UV-B輻射前后小麥葉片平均長度

2.2 增強UV-B輻射對小麥葉片總蛋白含量的影響

根據考馬斯亮藍G-250可與蛋白質相結合的特性測定濃度。以磷酸緩沖液為空白對照，設牛血清蛋白（BSA）不同濃度梯度，用分光光度計測定波長595nm處吸光值；每個樣品重復測定3次，根據測定結果，建立了標準曲線方程，繪制出標準牛血清蛋白曲線，用于樣品的測定（圖4）。

圖2 不同天數UV-B輻射前后小麥葉片總重量

圖3 不同天數UV-B輻射前后小麥平均葉面積

圖4 標準牛血清蛋白曲線

小麥經不同天數的UV-B輻射后，小麥葉片蛋白質含量也發生了顯著的變化，隨著天數的增加CK組小麥葉片蛋白質含量不斷增加，隨著天數的增加B組小麥葉片蛋白質含量也不斷增加；小麥生長到第3-5天B組小麥葉片蛋白質含量大于CK組小麥，且第4天的差異較大，小麥生長到第6-7天B組小麥與CK組小麥葉片蛋白質含量相差甚小，小麥生長到第8-9天CK組小麥葉片蛋白質含量大于B組小麥，且第8天差距較大（圖5）。

圖5 不同天數UV-B輻射前后小麥葉片蛋白質含量

2.3 小麥葉片聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖6-圖11所示為第4天、6天、8天，UV-B輻射前后蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳圖與其相應的凝膠分析圖。生長第4天的小麥CK組光密度小于B組（圖6）；生長至第6天的小麥CK組光密度與B組相差甚小，CK組略高于B組（圖8）；生長至第8天的小麥CK組光密度與B組差距較大，且CK組光密度大于B組（圖9）。

2.4 雙向電泳分析

如圖12-圖15所示，以生長至第4天、8天小麥的正常光照組（CK組）為一組，以第4天、8天小麥的UV-B輻射組（B組）為一組，進行UV-B輻射前后小麥葉片差異蛋白點的分析。如圖16，圖17所示，本研究中共獲取15個差異點：335，429這兩個蛋白差異點在CK組中為特異性表達，在B組中并未表達；228，704，671，937及793這5個蛋白差異點在CK組與B組中均有表達，在B組中表達 量 大 于 CK組 ；97，209，416，458，492，633，902及1136這8個蛋白差異點在CK組與B組中均有表達，在B組中表達量低于CK組。

圖6 生長至第4天UV-B輻射前后蛋白質SDS-PAGE圖

圖8 生長至第6天UV-B輻射前后蛋白質SDS-PAGE圖

圖10 生長至第8天UV-B輻射前后蛋白質SDS-PAGE圖

圖12 生長至第4天CK組蛋白質雙向電泳圖譜

圖7 生長至第4天蛋白質SDS-PAGE凝膠分析圖

圖9 生長至第6天蛋白質SDS-PAGE凝膠分析圖

圖11 生長至第8天蛋白質SDS-PAGE凝膠分析圖

圖13 生長至第4天B組蛋白質雙向電泳圖譜

圖14 生長至第8天CK組蛋白質雙向電泳圖譜

圖16 CK組蛋白質雙向電泳分析圖

圖15 生長至第8天B組蛋白質雙向電泳圖譜

圖17 B組蛋白質雙向電泳分析圖

2.5 部分差異蛋白質的質譜鑒定結果

選取UV-B輻射組B組和正常光照組CK組小麥葉片部分差異蛋白，進行膠內酶切，并應用MALDI-TOF-TOF/MS分析，通過MASCOT數據庫檢索，確定差異蛋白種類和功能。其中成功鑒定了3個蛋白質點（表2）。

表2 差異表達蛋白點的質譜鑒定結果

3 討論

3.1 葉片指標

葉片是對環境脅迫最敏感的植物器官之一。葉片平均長度、葉片總重量、平均葉面積都是測定小麥生長情況的重要生理指標。經不同天數UV-B輻射后小麥平均葉片長度、葉片總重量、平均葉面積都發生的顯著的變化。本試驗中小麥的葉片長度受到UV-B輻射后增長速度呈下降趨勢，這是因為UV-B輻射會增加乙烯的水平，從而減少伸長生長，這在葵花研究中已經得到證實［10］。Barnes等［11］研究表明，增強的UV-B輻射能破壞植物生長素，即增強的UV-B輻射夠通過改變植物的激素代謝水平，從而抑制植物的生長。Li等［12］研究發現，增強的UV-B輻射會降低小麥不同生育期葉面積指數，本試驗中小麥平均葉面積在增強UV-B輻射之后整體也出現了減小的變化，說明增強的UV-B輻射對小麥的葉面積產生一定的影響。孫林等［13，14］在研究增強UV-B輻射對冬小麥生長發育及產量的影響中表明，小麥產量在受到增強的UV-B輻射后會減少，UV-B輻射每增加10%，小麥產量降低24.3%。本試驗中經UV-B輻射后的小麥相對于正常光照組的小麥總重量降低。這可能與增強的UV-B輻射會破壞植物光合系統有關［15］，也可能與UV-B輻射后植株矮化、葉面積減少綜合導致植物生物量減少有關。

3.2 葉片蛋白

蛋白質是構成生物有機體的一個重要組成部分，而且是一種很好的生物催化劑，其在各種生物生理功能方面起著重要作用。蛋白質分子作為UV-B輻射最為敏感的靶分子，UV-B輻射可對其作多種修飾，包括色氨酸的光降解、-SH基的修飾、提高膜蛋白在水中的溶解度、促進多肽鏈的斷裂等［16］。這些修飾可以引起酶的失活和蛋白質的改變［17，18］。而且蛋白質的最大吸收波長正好在輻射（UV-B）的波長范圍（280-320 nm）內，因此增強的UV-B輻射會對蛋白質產生較大影響。本研究中增強UV-B輻射使小麥葉片中總蛋白含量增加速度減慢，增強UV-B輻射使小麥蛋白質分解代謝加強，這可能與增強UV-B輻射造成蛋白質結構改變有關，表明蛋白質含量的減少是由于UV-B輻射抑制了蛋白的合成，短時間的UV-B輻射會促進蛋白質的合成，而長時間的 UV-B則會抑制蛋白質的合成，加速分解。

鈣是高等植物中普遍存在的一種信號轉導分子，一些非生物刺激（如光照、冷、熱、缺氧、運動、干旱等）和生物刺激（如植物激素、抗原刺激等）所引起的生理生化反應都被證明與Ca2+信號轉導有關。本研究結果中分析出CaM在B組中上調表達，推斷增強的UV-B輻射引起了鈣濃度的變化，激發一系列信號轉導過程，進而引起一系列的反應。崔洪宇等［19］的研究表明，不同刺激引發的鈣信號可以引起不同的生理反應，以應答不同的外界刺激，提高植物體適應逆境脅迫的能力。

Rubisco在B組的表達量低于CK組，初步推斷，增強的UV-B輻射作為一種信號分子可能通過信號相關蛋白，引起一系列的反應，包括抑制Rubisco的活性，這與Allen等［20，21］的研究一致，增強的UV-B輻射抑制Rubisco活性，使其大小亞基及全酶的活性降低。

4 結論

UV-B輻射通過作用于小麥幼苗葉片中相關蛋白的信號傳導與轉錄、脅迫防御的能量代謝等調節小麥生長。

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