小麥種子萌發時期胚差異蛋白表達分析

劉向標 段江燕

（山西師范大學生命科學學院，臨汾 041000）

種子的萌發是植物生長的最關鍵時期。種子萌發時蛋白質的變化反映了植物基因組第一次被激活基因的表達情況［1］。高等植物中，種子在整個生命周期中占據著重要的地位，生物體在不同的發育階段會合成和分解類型和數量不同的蛋白質，這些動態變化的蛋白質構成了生物體某一時刻特征性生命活動的基礎，是認識生命活動本質的一個恰當而直接的途徑［2］。國內外對小麥在多種脅迫條件下的形態結構、生理生化機制方面進行的研究已經深入到DNA、蛋白質分子水平［3，4］。在外界脅迫的影響下，使種子體內的一些蛋白質的合成受到抑制，同時也促使一些新的蛋白質的合成引發種子體內的代謝變化［5］。但萌發的調控等一系列復雜的生理生化過程如何相互協調還不甚清晰，成熟的種子蛋白質作為生命活動的執行者，既能反映基因組被激活后基因的表達情況，同時又能反映種子相對靜止狀態到活躍的生理生化代謝的轉變過程。為此，通過對小麥種子萌發不同時間的差異蛋白的研究，對探討小麥種子萌發機制具有重要意義。

蛋白質組學技術為研究蛋白質的動態變化提供了重要的技術支撐，可對生物細胞或組織蛋白質表達進行定性或定量的綜合分析，尤其可用于揭示不同條件下蛋白質表達的變化。該技術具有高通量、高靈敏度、高分辨率、重復性好等優點［6］。核心技術包括雙向電泳技術（two-dimensional electrophoresis，2-DE）和質譜技術（mass spectrometry，MS）［7］。目前該技術方法僅在擬南芥、大麥、橡膠種子等少數植物有相關報道［8］。但尚未見對小麥種子不同萌發時期差異蛋白質組和質譜分析的報道。

本試驗以“晉麥-47”為材料，比較小麥種子萌發前期胚蛋白質表達的差異，并進行質譜鑒定，揭示種子從相對靜止狀態到活躍狀態過程中涉及的差異蛋白表達情況，以期為小麥種子萌發的調控機制研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

小麥種子（晉麥-47）由山西省農科院小麥研究所提供。 主要試劑：Triton X-100、超純水、蒸餾水、丙酮、過硫酸銨（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N'、N'四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋白（BSA）、冰乙酸、甘油、兩性電解質（Bio-Lyte）1%溴酚藍、1 mol/L鹽酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、低熔點瓊脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85﹪磷酸、二硫蘇糖醇（DTT）、95﹪乙醇、考馬斯亮藍G-250和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）

1.2 方法

1.2.1 不同萌發時期小麥種子胚樣品的制備 選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的種子650 粒。（經0.1% HgCl2溶液浸沒消毒2 min后再用純水漂洗5次），置于25 mL純水，鋪有雙層定性濾紙的玻璃培養皿中，每皿50 粒，蓋上蓋。25℃恒溫避光處理發芽。隨機選取吸脹后0、0.5、1、2、3、5、7、10和13 h，之后每隔3 h取一次直至25 h胚根突破種皮2-3 mm為止，測定種子的鮮重和干重，均重復3次，初步確定小麥胚的選取時期。

1.2.2 蛋白樣品的提取 用尿素/硫脲法提取小麥胚蛋白，把在不同時期取出的小麥胚樣品在液氮中磨成粉末加入離心管中，加入尿素/硫脲蛋白提取液振蕩30 s，離心15 min后，取上清液再重復離心，收集上清液，加入3倍體積冷丙酮，并放入-20℃的冰箱里過夜，次日后收集沉淀（視具體情況可再加一次，離心同上），4℃放置，使丙酮充分發揮，待沉淀干燥后，溶于400 μL樣品裂解液，4℃冰箱中過夜，第二天離心取上清液，得到蛋白質樣品液，4℃放置待用。

1.2.3 小麥種子胚可溶性蛋白的雙向電泳 取出已經配好的水化上樣液，加入0.001 g DTT，5 μL的40% Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均質的水化上樣液與蛋白樣品溶液以4∶1混勻，即為上樣液。采用pH3-10，7 cm線性IPG預制膠條。主動水化在50 V電壓下12 h后，經過250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、4 000 V 3 h、最后穩定在4 000 V下進行20 000 Vh，500 V快速保持時間視情況而定。聚焦完畢后，膠條先在平衡液Ⅰ［尿素36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）25 mL、甘油20 mL、DTT 0.2 g］中，在搖床上平衡15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM代替0.2 g DTT，其余組分同平衡Ⅰ）中平衡15 min。然后進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%。

1.2.4 考馬斯亮藍染色 剝離凝膠立即放入固定液（12% TCA）中固定2 h，充分固定后用雙蒸水洗3次，每次5 min，取出放入考馬斯亮藍染液（20﹪甲醇、1.8%磷酸、8﹪硫酸銨、0.08%的考馬斯亮藍G250染色至少2 h，脫色液（7﹪、5﹪甲醇）脫色1 h后換用雙蒸水進行脫色，直到蛋白點清晰為止。

1.2.5 2-DE圖像分析 凝膠用掃描儀（UMAX）進行掃描，得到蛋白圖像用PDQest軟件進行分析包括背景消減、斑點檢測、匹配、獲取斑點位置坐標和蛋白質點的標準化分析等。

1.2.6 蛋白質點膠內酶解及肽指紋圖譜分析 選取重復性較好的差異表達量在2.5倍的蛋白點進行膠內酶解，將酶解肽段重新溶解于0.7 μL 0.5g/L的CHCA溶液（0.1%TFA+50%ACN）中，在靶板上點樣。樣品用4700串聯飛行時間質譜儀進行質譜分析。所得質譜結果用GPS-MASCOT軟件進行數據庫檢索。

2 結果

2.1 小麥種子胚萌發前期取樣時間的確定

根據萌發過程中小麥種子含水量的不同，將分為3個時期，分別是第一時期吸脹吸水期，第二時期緩慢吸水期，第三時期生長吸水期。生長吸水時期的胚根突破種皮2-3 mm，分別測定13個時間段種子干重和濕重，得到“晉麥-47”種子的含水量（圖1）同時間的關系，以初步確定小麥種子萌發前期的取樣時間。從圖中可看到小麥種子萌發前期的3個階段，分別是從0 h（干種子）-3 h，種子含水量快速從0 g增加到0.06 g；3 h-16 h，種子含水量緩慢增加，從0.06 g增加到0.19 g；17 h-25 h（胚根突破種皮2-3 mm）種子含水量快速從0.19 g增加到0.24 g。87%的種子露白發生在第三個階段，表明小麥種子出芽時間比較集中。為此，將種子萌發前期過程中蛋白質的取樣時間初步定在0、3、16和25 h。

圖1 小麥種子萌發過程水分含量的變化

2.2 小麥種子總蛋白提取的方法比較

本試驗分別采用酚提-甲醇/醋酸銨沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和尿素硫脲法提取小麥種子中胚蛋白，為確定合適的提取方法每個方法重復3次。分別進行SDS-PAGE（圖2），結果顯示，不論在蛋白條帶的數目還是染色的深淺方面，3種蛋白提取方法得到的蛋白樣品均有所不同。酚提-甲醇/醋酸銨沉淀法對種子中胚蛋白的提取效果明顯弱于TCA/丙酮沉淀法和尿素硫脲法。從圖2還可看出，在高分子量區，TCA/丙酮法的提取效果不如尿素硫脲法，因能明顯看到這種方法在此范圍會丟失部分蛋白，相比較而言，尿素硫脲提取的蛋白更加完整。

圖2 不同提取方法的SDS-PAGE分析結果

2.3 小麥種子萌發過程中蛋白含量的變化

為了進一步探究小麥種子萌發過程中蛋白含量的變化，本試驗分別采用0、0.5、1、2、3、5、7、10、13、16、19、22及25 h的小麥種子作為材料，用尿素硫脲法進行總蛋白的提取，進行SDSPAGE分析（圖3）。結果顯示，不論是3 h、16 h和25 h，小麥種子胚蛋白的含量與未萌發的相比，含量均有所上升，萌發3 h時與0 h的差異不顯著；萌發16 h時，與0 h相比其差異顯著；萌發25 h后，與0 h相比差異極顯著。因此，將種子萌發前期過程中胚蛋白質的取樣時間定在0、3、16和25 h 4個時期是合理的。

圖3 不同時段小麥種子胚蛋白的SDS-PAGE分析結果

2.4 不同萌發時期小麥種子蛋白的雙向電泳圖譜分析

通過嚴格一致3次重復的雙向電泳操作獲得0 h、3 h、16 h和25 h等 4個時期重復性較高的2-DE電泳圖譜（圖4），在pH3-10，分子質量14.4-94.0 kD范圍，利用PDQuest軟件分析0 h與3 h的蛋白點相關系數（Correlation coefficient）為86.3%，與16 h的為84.9%，與25 h的為83.7%，說明蛋白質漸近變化。

2.5 差異表達蛋白的MALDI-TOF-MS分析及數據庫檢索

圖4 “晉麥-47”萌發前期不同時期種子胚蛋白質2-DE電泳圖譜

2-DE凝膠上面的蛋白點相對量隨著小麥種子萌發初期發育進程的出現與否和表達量的增減，通過PDQuest軟件分析出對重復性、表達量變化超過2.5倍以上的9個差異蛋白質點進行MALDI-TOF-MS分析，以基質峰、酶自動降解片段峰進行校正，去掉角蛋白峰和胰酶自切峰，精確標定強度為基質峰強度2倍以上的峰，9個蛋白點均獲得肽質量指紋圖譜（PMF），圖5是蛋白點6的肽段串聯質譜圖。共鑒定得到4個差異蛋白（表1）分別為核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kD熱休克蛋白、ATP合酶和LEA蛋白27。

圖5 ATP合酶質譜圖

表1 差異表達蛋白的查詢結果

3 討論

3.1 小麥種子萌發過程中蛋白取樣時期的確定

選擇合適的時期進行蛋白取樣，對后續的蛋白質組學分析至關重要。種子萌發分為吸脹吸水期、緩慢吸水期、生長吸水期。種子細胞在不同發育階段的蛋白質在種類和數量上是不同的，反映在種子萌發過程中不同階段的發育特點上。通過對不同時期小麥種子含水量指標的測定，初步選定0、3、16和25 h作為取樣時期。據此，進一步結合13個不同時期的蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測，把吸脹0 h作為休眠干種子代表時期，吸脹3 h作為吸脹吸水期的代表，吸脹16 h作為緩慢吸水期的代表，吸脹25 h作為生長吸水期的代表。因此，分別在0 h、3 h、16 h和25 h等4個時期進行蛋白取樣。

3.2 小麥種子萌發過程中胚差異蛋白分析

植物在生長時期表現出來的蛋白質動態變化，共同構成了細胞各個時期生命的基礎。小麥種子在萌發時期的蛋白質變化，反映出小麥基因組從休止到開啟、翻譯、表達的過程。因此，了解蛋白質的變化為認識生命活動本質提供了一個直接途徑［9］。

與種子生長、能量代謝相關的蛋白：蛋白點1被鑒定為核苷二磷酸激酶Ⅰ（NDPKⅠ），在小麥種子萌發16 h時表達量增加，一直到25 h保持著較高的表達水平，表明此時核酸合成活躍，維持細胞核內NDP和NTP代謝的平衡（NTP +NDPK= NDP+NDPK-P；N=G、T、C、U）進行磷酸化與脫磷酸化反應［9］，有利于種子的生長；蛋白點6被鑒定為ATP Synthase（ATP合酶），在種子萌發25 h表達量最高，此時胚根突破種皮需要消耗大量能量。研究表明，ATP合酶在線粒體和細菌中廣泛存在［11，12］，依靠質子動力勢合成ATP也能水解ATP形成機體重要的質子梯度，其主要功能是合成ATP。

與種子抗性和抗氧化性相關蛋白：蛋白點3被鑒定為17.5 kD熱激蛋白（HSP），在25 h大量表達，可能是與打破休眠后保護萌發過程中細胞膜結構系統和抗氧化系統免受傷害，保證小麥種子的順利萌發。研究表明，HSPs的生成與生物耐熱性相關，HSP105在熱激時能迅速移到核內，并在核仁和核質中積累，在熱激解除時，又遷到細胞質中具有保護細胞機體免受損害的作用［10］；蛋白點8被鑒定為27 kD種子成熟蛋白在25 h時出現，可能與GmPM4一樣供種子萌發時維生素的需求，絕大部分種子成熟蛋白屬于LEA蛋白家族成員（如GmPM1、GmPM8和GmPM9等）都有LEA蛋白保守機構域，種子成熟蛋白GmPM4含有TENA-THI-4保守結構域，屬于硫胺（維生素）家族［13］。Roy等［14］曾報道，Gm-PM4可作為維生素的一種貯藏形式供種子萌發所用。

4 結論

本研究發現“晉麥-47”小麥種子未萌發和萌發3 h、16 h和25 h的胚的2-DE凝膠通過PDQuest圖像分析軟件可識別的蛋白點約有127、131、135和141個，其中表達量變化2.5倍以上的蛋白點有17個，選取表達量在2.5倍以上的9個差異蛋白點進行質譜鑒定，初步鑒定出4個蛋白質分別是核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kDa熱休克蛋白、ATP合酶和LEA蛋白27，分子量分別為16.0、18.3、12.3和26.5 kD；等電點分別為6.9、6.2、5.8和6.2。

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