馬鈴薯StSnRK2.1基因克隆與生物信息學分析

劉思妍 毛娟 范阿棋 張俊蓮 王蒂 白江平

（甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室 甘肅農業大學農學院，蘭州 730070）

蔗糖非發酵相關蛋白激酶家族（SnRKs）在植物許多生理過程中起著重要的作用，根據基因序列的相似性和基因結構的不同將其分為3個亞家族，分 別 是 SnRK1，SnRK2 和 SnRK3［1-3］。SnRK2 亞 家族是植物中所特有的一類，參與植物逆境脅迫，對植物抵御不良環境具有一定的調節作用，已在擬南芥、水稻、玉米中克隆并鑒定了其功能［4，5］。

馬鈴薯作為糧菜兼用型作物，在作物生產中占有極其重要的作用，尤其對我國西部干旱地區。但是馬鈴薯對干旱、高溫等非生物性脅迫的響應遺傳機理與種質的改良還都處于初始階段［6-8］，其原因一方面是植物響應逆境脅迫的數量遺傳背景以及生理機理的復雜性使得抗旱育種的進展非常緩慢［9，10］，另一方面是因為馬鈴薯多倍體遺傳背景的復雜性限制了對馬鈴薯功能基因組的研究和生物技術在馬鈴薯種質改良中的應用［11-17］。SnRK2家族基因被認為與植物響應逆境脅迫有緊密聯系［18，19］，甘肅主栽品種隴薯3號與其他品種相比具有明顯的抗旱性。本研究從隴薯3號中分離SnRK2基因家族并對其功能進行分析預測，擬使其對改善植物抵抗逆境脅迫研究具有積極地推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯試管苗（隴薯3號）由甘肅省遺傳改良與種質創新重點實驗室保存。

E. coliDH5α，本實驗室保存；載體pGEMTeasy，購自Promega公司；RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自TIANGEN公司；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、DreamTaqTMGreen PCR Master Mix（2X）及引物設計由上海生工生物工程有限公司承擔。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 按照TIANGEN公司的RNA提取試劑盒操作說明書提供的方法提取馬鈴薯試管苗總RNA。參照上海生工的反轉錄試劑盒的操作說明得到反轉錄產物并保存在-20℃下備用。

1.2.2 RT-PCR法擴增StSnRK2.1基因 根據SnRK2同源序列設計引物：上游引物為：5'-GCTCTAGAATGGAGCGTTATGAGATAGTGAAG-3'（下劃線部分為XbaⅠ酶切位點）；下游引物為：5'-GCGAGCTCTC ACAGTAAACCAGCAAAATCAG-3'（下劃線部分為SacⅠ酶切位點）。擴增條件為：95℃ 1 min，95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，40個循環，72℃ 10 min。PCR產物經膠回收試劑盒純化后保存在-20℃下備用。

1.2.3 載體pGEM-Teasy的構建 將純化后的PCR產物與T-esay載體相連接，并將連接產物轉化入感受態細胞。感受態細胞的制備參照《分子克隆實驗指南》［19］。

1.2.4 重組質粒的鑒定及測序 將轉化細胞涂布在含25 μL（20 mg/mL）IPTG，15 μL（50 μg/mL）X-gal，100 μL（25 μg/mL）Ampr的 LB 平板上進行藍白斑篩選，隨機挑選白色菌斑 加入含Ampr抗生素的LB液體培養基中搖蕩過夜進行菌液PCR檢測陽性克隆。然后再通過質粒滯后及酶切鑒定后送測序。

1.2.5 生物信息學分析 將含有目的片段的菌液送生工測序。通過NCBI網站上的blast搜索引擎對測序結果進行同源性分析；利用ExPASy網站對StSnRK2.1基因的編碼蛋白進行氨基酸組成、等電點等理化性質及親/疏水性進行分析；利用CBS網站上提供的軟件進行跨膜分析；利用WoLF PSORT網站對基因編碼蛋白進行亞細胞定位的預測；利用DNAMAN軟件完成對分子進化樹的構建；利用PredictProteinPHD信息庫對蛋白質序列進行二級結構預測；利用NetPhos2.0 Server進行蛋白磷酸化預測。

2 結果

2.1 馬鈴薯總RNA提取及RT-PCR擴增目的基因

提取馬鈴薯試管苗總RNA，結果如圖1所示，提取的RNA28S，18S，5S條帶清晰、完整，說明RNA沒有發生降解，能夠用于反轉錄。以反轉錄產物為模板，采用RT-PCR擴增目的基因，結果如圖2所示，擴增出與預期大小相符的特異性條帶，在1 000 bp左右。

圖1 馬鈴薯總RNA電泳圖

2.2 目的基因的克隆與鑒定

將擴增得到的目的基因片段回收并且與pGEMTeasy 連接并轉化到大腸桿菌DH5α中，通過藍白斑篩選，挑選白色重組質粒進行菌落PCR鑒定，結果如圖3所示，能夠擴增出大小為1 000 bp左右的預期片段；用EcoR I 酶切質粒，能夠切下預期的片段（圖4），說明可能獲得了馬鈴薯StSnRK2.1的cDNA片段。

2.3 StSnRK2.1基因cDNA序列分析

將重組質粒送上海生工進行測序，測序結果如圖5所示，該基因開放閱讀框全長1 008 bp，編碼335個氨基酸，將基因命名為StSnRK2.1。

2.4 StSnRK2.1基因系統發生樹的構建

圖2 StSnrk2.1基因擴增結果

圖3 StSnrk2.1基因菌液PCR結果

圖4 酶切StSnRK2.1

圖5 StSnRK2.1基因全長序列及編碼氨基酸序列

利用DNAMAN軟件構建了SnRK2基因的系統發生樹，結果如圖6。利用該軟件對其進行多重序列比對，結果表明，StSnRK2.1與蒺藜苜蓿的SnRK基因相似性最高，為77.65%；與蓖麻SnRK基因相似性次之，達77.22%；與高粱SnRK基因相似性也較高，達75%。為了更好地了解不同物種中SnRK2的同源關系，將StSnRK2.1與其他植物一起進行基因的同源性分析，結果如圖7所示。從圖7可以看出，該基因家族在N端相對保守，而在C端則特異性極其明顯。

圖6 不同植物SnRk2基因的系統發生樹

2.5 StSnRK2.1基因編碼蛋白的一級結構及親水性分析

對編碼該基因的氨基酸種類及數量統計，如表1所示。氨基酸的親水性分析數據表明該基因編碼蛋白在第50個氨基酸附近具有最大親水位置，在第200個氨基酸附近有最大疏水位置，且在較多位置上均表現出疏水性，可見該基因可能屬于疏水性（圖8），該基因的跨膜分析結果表明該肽鏈有3個跨膜區域，但是蛋白并未跨膜。

2.6 StSnRK2.1基因編碼蛋白的二級結構分析及亞細胞定位

利用SOPMA網站預測馬鈴薯StSnRK2.1基因編碼蛋白的二級結構，發現其二級結構主要有4種類型，分別為α-螺旋，β-折疊，延伸鏈和無規則卷曲，其中主要以α-螺旋為主，β-折疊最少，具體數據如表2所示。對于該基因的亞細胞定位分析是通過PSORT網站完成，由結果（表3）可知該基因出現在細胞質及微體中的可能性較大。

2.7 StSnRK2.1基因編碼蛋白的三級結構預測及磷酸化位點分析

利用ExPASy網站上提供的軟件對該基因的編碼蛋白進行三級結構的預測，可以清楚地看到該蛋白具有豐富的α-螺旋結構，無規則卷曲也較明顯（圖9），從而驗證了SOPMA網站對其二級結構的預測。該基因磷酸化位點的分析結果（圖10）顯示該肽鏈有7處絲氨酸磷酸化位點，2處蘇氨酸磷酸化位點，以及3處酪氨酸磷酸化位點。

3 討 論

在不同的生態條件下，植物體逐漸形成了不同的生理反應機制，尤其是對逆境脅迫的抵抗。研究表明，SnRK2家族基因在逆境環境中起重要作用［20-24］。本研究利用同源克隆的方法從馬鈴薯試管苗RNA中成功克隆得到SnRK2的同源基因—StSnRK2.1，將測序所得堿基序列與預測堿基序列通過DNAMAN軟件進行比對，發現二者相似性達98.61%，其中只有13個堿基發生變化，發生這種現象的原因可能是因為克隆時所使用的模板與網站上提交的序列不是來自同一品種馬鈴薯；另一種原因可能是在擴增過程中堿基發生了突變。但是當對兩個序列的氨基酸進行比對時發現二者相似度高達100%，因此可以猜測堿基不同是由于馬鈴薯品種不同而使同一氨基酸的密碼子不同導致的。此外，將StSnRk2.1基因的編碼蛋白與另外10個物種的蛋白質序列進行同源性比較時發現，這些基因在N端具有一定的保守性，而在C端則高度特異，據此推測該基因在進化過程中是比較保守的，對逆境脅迫的響應可能與SnRK2家族中的其他基因一樣具有一定的一致性。

表 1 StSnrk2.1基因編碼蛋白的氨基酸含量

圖7 StSnRK2.1基因與其他物種中Snrk2家族基因進行多序列比對

圖8 StSnRK2.1基因編碼蛋白的親水性分析

表2 StSnRK2.1基因編碼蛋白的二級結構分析

表3 StSnRK2.1基因編碼蛋白的亞細胞定位分析

圖9 StSnRK2.1基因編碼蛋白的三級結構

圖10 StSnRK2.1基因磷酸化位點分析

蛋白質的磷酸化是最普遍、最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式。它是植物在逆境脅迫條件下體內能量代謝和信號傳遞中的重要生化反應［25］。一般來說，多肽鏈的氨基酸潛在的磷酸化位點越多，發揮更多功能的可能性就越大。從分析所得的數據中，該肽鏈有7處絲氨酸磷酸化位點，2處蘇氨酸磷酸化位點，以及3處酪氨酸磷酸化位點可知該肽鏈潛在的磷酸化位點較多。由此也可推測，StSnRK2.1可能也是通過可逆的磷酸化反應對逆境脅迫進行感知和應答的。

4 結論

本研究從馬鈴薯試管苗中克隆得到1個SnRK2.1基因，命名為StSnRK2.1。通過生物信息學分析，得到了該基因開放閱讀框全長及其編碼氨基酸，蛋白質分子量、等電點、蛋白質二級結構以及親疏水性，通過分析認為其為膜內蛋白，亞細胞定位顯示該基因出現在細胞質及微體中的可能性較大。肽鏈有7處絲氨酸磷酸化位點，2處蘇氨酸磷酸化位點，以及3處酪氨酸磷酸化位點，推測該基因在植物抗逆中起一定作用。

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