泛素-蛋白酶體通路及其與膽道疾病相關性研究進展

楊建輝 魯葆春

泛素-蛋白酶體通路及其與膽道疾病相關性研究進展

楊建輝 魯葆春

泛素-蛋白酶體通路（UPP）是真核生物細胞質和細胞核內依賴于ATP、非溶酶體途徑的蛋白質降解通路。UPP通路不僅能降解變性、異常或起短暫作用的蛋白質，而且能降解植物色素、轉錄因子、內膜蛋白和細胞周期蛋白等天然蛋白質，因而在轉錄水平調節、蛋白質降解、蛋白質穩定狀態調節、程序性細胞死亡、細胞周期控制和免疫介導等過程中起重要作用，因此泛素介導的蛋白質降解通路的異常與許多疾病，如惡性腫瘤、膿毒血癥所致肌肉萎縮等密切相關。筆者就UPP與膽道疾病相關性的研究進展作一綜述。

1 UPP的組成

真核細胞主要有兩種蛋白質降解通路，一種是溶酶體通路，主要降解經胞吞進入細胞的胞外蛋白質；另一種是非溶酶體通路，即UPP，主要經細胞內的蛋白酶體降解泛素化蛋白質。UPP主要由泛素（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素偶聯酶（E2）、泛素連接酶（E3）、泛素鏈延長酶（E4）、去泛素化酶（DUB）、蛋白酶體等組成。

1.1 Ub Ub是真核細胞內一種由76個氨基酸組成的球形熱穩定蛋白，分子量為8.45kD，其結構在真核細胞中高度保守，在不同生物體間組成Ub的氨基酸序列差別很小，如酵母和人的Ub僅有3個氨基酸序列的差別。因其在體內廣泛存在、含量豐富而被稱為Ub。Ub以自由形式和復合物形式兩種存在，其功能位點為C2端的76位Gly殘基和Lys殘基，Gly殘基上的羧基能與靶蛋白的Lys殘基上的氨基形成異構肽鍵。另外，不同Ub分子的Gly殘基與Lys殘基之間結合，可形成一條長鏈[1]。Ub的功能主要是通過異構肽鍵結合胞漿內錯誤折疊或半衰期較短的蛋白，并以此指導蛋白酶體依賴的蛋白質降解。

1.2 Ub相關酶 蛋白的Ub化是由Ub相關酶啟動的，是蛋白降解的關鍵步驟，是一種蛋白級聯反應。E1水解ATP釋放能量，使其半胱氨酸殘基（Cys）的氨基與UbC2端的Gly的羧基形成高能硫酯鍵，從而激活Ub。而后活化的Ub（E1-Ub復合物）轉酰基作用被轉移到E2活性Cys上，并釋放出E1，以新的高能硫酯鍵結合形成E2-Ub復合物。E2-Ub復合物可直接與特定的靶蛋白形成Ub-蛋白復合物。而在大多數情況下，需通過E3這個底物連接因子先與靶蛋白特異性結合，E2-Ub才獲得與靶蛋白相互接近，繼而靶蛋白與E2酶連接的Ub結合，從而完成靶蛋白的Ub化。在啤酒酵母菌研究中發現，Ub鏈延長酶E4，多個靶蛋白-E3復合物在其幫助下能連接形成長Ub鏈，稱之為多聚Ub化修飾[2]。部分靶蛋白必須經多聚Ub化修飾后才能被蛋白酶體識別水解[3]。

細胞內同時存在去Ub化，是Ub化過程的逆轉。Ub-靶蛋白偶聯后，進入26S蛋白酶體內靶蛋白被降解，同時在特異性水解酶（去Ub化酶）的作用下能夠解離Ub分子，可被重復利用。去Ub化酶主要有兩大類：Ub羧基端水解酶（UCHs）和Ub特異性修飾酶（UBPs/USPs），均能催化水解Ub和底物蛋白之間的硫酯鍵，起到去Ub化作用，還能將錯誤識別的底物從Ub化復合體中釋放出來，并重新釋放出Ub分子。UCHs屬于半胱氨酸蛋白酶，可以通過裂解UbC末端Gly將Ub分子從小的多肽底物上釋放出來，也參與多聚Ub鏈產生Ub單體的過程。UBPs含有2個短而保守的片段，即Cys盒和Hi盒，能將Ub分子從大的蛋白上移除。兩類酶都能參與去除和解聚底物蛋白質上的多聚Ub鍵，從而防止多聚Ub在底物蛋白的聚集，而以Lys48方式連接的多聚Ub鏈結構對去Ub化酶有對抗作用[4]。

1.3 蛋白酶體 蛋白酶體是Ub化蛋白的降解場所，存在于細胞核和細胞質內，主要發揮生物性效應是26S蛋白酶體。26S蛋白酶體包含1個20S核心蛋白酶和兩個19S調控復合物，20S是具有蛋白酶體催化活性的核心顆粒，由4個并列環狀中空圓柱狀顆粒物構成，兩端的顆粒物構成2個α環，中間的顆粒物構成2個β環。α環亞基負責靶蛋白的識別，而β環參與靶蛋白的降解，3個不同肽酶活性均位于β環的亞基上，分別為糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣和半胱氨酸蛋白酶樣活性。進入26S蛋白酶體的蛋白質被多次切割，最后形成3～22個氨基酸殘基的小肽。19S是具有調節功能的調節顆粒，由包含6個AAA-ATP酶的堿性亞復合體和包含8個非ATP酶的亞復合體組成，參與對靶蛋白的特異性識別。多聚Ub鏈形成后，可與蛋白酶體19S Ub受體相互作用，使靶蛋白去折疊進入26S蛋白酶體催化中心被降解。

2 Ub-蛋白酶體通路的功能

Ub和蛋白酶體分別是整個UPP的起始環節和核心位點，利用Ub化或去Ub化可以調控細胞內蛋白質水平并影響其功能。研究已證實，Ub介導了細胞內80%～90%的蛋白降解，參與了細胞周期循環、信號轉導、炎癥反應、DNA損傷修復、細胞凋亡及抗原遞呈等許多生命過程。

細胞周期調控因子Ub化，然后由26S蛋白酶體降解，導致周期因子依賴的激酶失活，從而使細胞有絲分裂期中止。p53作為轉錄因子可以誘導細胞周期抑制因子和促凋亡基因的表達，當DNA受到損傷或發生不正常的細胞增殖時p53就會被激活，使細胞周期停止或使細胞發生凋亡。Anwar等[5]用蛋白酶體抑制物MG-132處理黑色瘤細胞，p53蛋白水平升高，半衰期延長，由此可見細胞中p53蛋白水平的調節主要是通過UPP通路來實現。

細胞信號轉導通路中多種調節蛋白通過UPP活化和降解，控制著細胞的分化、生長、凋亡等過程，如UPP對核內轉錄因子NF-κB信號通路的調控。NF-κB是一多亞基組成的轉錄因子，其抑制因子IκB磷酸化后被26S蛋白酶體降解從而導致NF-κB以活性方式存在，相關的基因表達增強[6]。NF-κB可與IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α等細胞因子和炎性介質的基因啟動子區域固定核苷酸序列結合，啟動基因轉錄。

抗原分子Ub化后被26S蛋白酶體降解成多肽，然后由組織相容性復合體MHC I類分子提呈至細胞表面，應用蛋白酶體抑制劑可阻滯提呈至MHCⅠ類分子細胞表面多肽的產生。而膿毒癥狀態下的骨骼肌蛋白過度代謝亦是由UPP介導的。可見免疫、炎癥反應、各種病理狀態下的骨骼肌代謝等都與Ub-蛋白酶體通路有關。

3 Ub-蛋白酶體通路的調控

UPP降解許多蛋白，而這些蛋白帶有某些能被Ub系統識別的信號，稱作降解信號。有些天然蛋白，其降解信號被隱藏在疏水核心中，蛋白不被降解，但當蛋白結構變化出現部分解鏈區，降解信號就會暴露而被Ub系統發現并降解，這證實為何部分折疊、異常和突變蛋白易被降解的原因。有些氨基酸序列就是降解的信號，如轉錄因子Gcn4p，有281個氨基酸，91～106位氨基酸序列稱為PEST序列，此蛋白正常的半衰期大約為5min，若將PEST序列移除，半衰期增加到50min。蛋白質N-末端氨基酸序列可預測它的半衰期，即N-末端規則，如蛋白質N-末端是天冬氨酸，半衰期為3min，若是絲氨酸，半衰期可長達20h。一旦多聚Ub化鏈接到蛋白上，蛋白必將運送到蛋白酶體，被展開然后降解，這些步驟依賴于降解信號或靶蛋白自身特性的調控。

UPP被特異性調控，主要是E3對靶蛋白序列或降解信號來特異性地識別和降解，決定反應的特異性。根據識別靶蛋白序列中結構域不同，E3分為兩類：（1）HECT型E3連接酶，結構域上的半胱氨酸殘基與E2攜帶的Ub以硫酯鍵連接形成復合物Ub-E3，再將Ub轉移到靶蛋白上[7]。（2）RING-finger E3連接酶，包含一個RING-finger結構域，可以與Ub-E2形成復合體，但其本身不與Ub發生作用，不能以硫酯鍵直接與Ub結合，只是將Ub轉移給靶蛋白[8]。

4 Ub-蛋白酶體通路與膽道疾病的關系

4.1 UPP與膽道感染 急性重癥膽管炎（ACST）是在膽道完全梗阻的基礎上發生的一種嚴重的急性膽道感染，存在著細菌易位和腸源性內毒素血癥。占全身單核巨噬細胞系統85%～90%的肝枯否細胞（KCs）是膽血屏障的重要組成部分，是清除來自膽道和腸道內細菌及其內毒素的主要場所。

ACST時，動物血循環中內毒素（LPS）水平顯著增加，KCs吞噬能力受到嚴重損害。而膽道梗阻后血循環中的脂多糖結合蛋白（LBP）水平也顯著提高[9]。LPSLBP復合物形成后，與KCs表面脂多糖受體CD14借助于糖基磷脂酸肌醇相結合并將LPS的刺激信號傳遞細胞內，激活KCs胞漿內的NF-κB核轉錄因子。在靜息狀態下，NF-κB存在于胞質內并與抑制因子（IκB）結合形成無活性的三聚體復合物。ACST時，當LPS的刺激信號傳人細胞內后激活NF-κB誘導激酶，使IκB磷酸化，通過UPP被26S蛋白酶體降解，從而使NF-κB活化，并露出其核定位信號，特異性結合在DNA序列上，引起許多因子的轉錄，包括促炎因子IL-1β、IL-6等。Gong等[10]的研究表明，ACST患者外周血單核細胞內NF-κB活性明顯增強，其增強的程度與膽道感染的程度密切相關，并與患者的預后相關。

ACST時，膿毒癥發生率為100%，伴有嚴重的代謝性酸中毒，且常伴發1個或多個臟器的功能障礙。研究表明，膿毒癥時骨骼肌蛋白的降解是由于Ub-蛋白酶體途徑被激活的。內毒素、TNF-α等介質是直接或間接導致骨骼肌蛋白降解的重要誘導或調節因子，抑制炎癥介質NF-κB途徑可有效降低嚴重膿毒癥狀態下的骨骼肌蛋白降解率[11]。Mutsvangwa等[12]建立奶牛酸中毒模型研究酸性代謝中肌蛋白降解增加的機制，發現ATP參與了其反應過程，而溶酶體和鈣離子激活酶則未參與，酸中毒大鼠骨骼肌組織中UbmRNA量增加了25%、E2mRNA量增加了34%，蛋白酶體C8亞基mRNA增加了20%，從而進一步證實UPP上調是酸中毒時骨骼肌流失的蛋白質增加內在機制。

4.2 UPP與膽道梗阻 急慢性膽道梗阻可引起膽汁性肝硬變，可伴隨機體負氮平衡，體重的減輕。Lin等[13]將成年雄性大鼠膽道結扎誘導膽汁性肝硬變，發現膽道結扎大鼠的肌肉蛋白降解率增高，Ub、Ub載體蛋白E2、蛋白酶體亞基C8和C2的基因表達增強，肌肉蛋白中游離Ub和結合Ub的水平均升高，而其中TNF-α在整個機制中起到了重要作用。Wang等[14]的研究表明，膽道結扎誘導膽汁性肝硬變大鼠，骨骼肌蛋白硝化、Ub化明顯加強，注射左旋-硝基精氨酸甲脂治療后骨骼肌Ub化水平明顯下降。在原發性膽汁性肝硬變患者研究中，免疫組化染色提示膽管上皮細胞Ub明顯提高，熊去氧膽酸可減少其表達[15]。

4.3 UPP與膽道腫瘤 E3為Ub蛋白酶體降解途徑中的關鍵酶，能特異性識別底物蛋白并使其Ub化，RING-finger E3連接酶以cullins蛋白作為模板裝配而成，cullin家族已發現有cul-1、cul-2、cul-3、cul4A、cul4B、cul-5和cul-7等7個成員；cul-1作為cullins蛋白代表性成員，其組裝的復合體具有典型的Ub連接酶活性。新近研究證實，cu1-1介導許多細胞相關的功能蛋白的降解過程，有效地調節著細胞周期進程，其異常改變可能在惡性腫瘤發生、發展中有極重要作用。劉棟才等[16]的研究表明，膽囊腺癌Ub和cul-1表達陽性率分別為51.9%和48.1%，明顯高于癌旁組織、腺瘤性息肉、慢性膽囊炎膽囊上皮，膽囊腺癌中Ub表達水平與cul-1表達水平呈高度一致性。劉燕雷等[17]采用免疫組織化學法結合蛋白印跡技術檢測人膽道腫瘤組織、正常膽道組織及炎性組織中Ub蛋白的表達，發現膽道腫瘤組織中Ub蛋白的表達顯著高于正常組織及炎性組織中Ub蛋白的表達，表明Ub蛋白在人膽道腫瘤組織中表達水平升高，可能與膽道系統腫瘤的惡性程度、疾病的進程密切相關。

USP14屬于Ub特異性蛋白酶家族，Chuensumran等[18]采用實時定量PCR方法研究發現，在膽管細胞癌患者腫瘤組織中USP14基因表達明顯上調，其表達水平與腫瘤臨床病理特征、組織學分級相關，與病理分期、淋巴結轉移等無明顯相關。人突變基因p27表達蛋白是一種熱穩定蛋白，主要抑制細胞周期因子E-CDK2復合體的活性，同時也能抑制細胞周期因子D-CDK4和細胞周期因子A-DK2復合體，還能下調細胞周期因子B的表達。p27蛋白的降解主要由受Ub介導的第187位蘇氨酸磷酸化引起的。Sasaki等[19]采用腺病毒誘導野生型 p27kip1突變，基因片段由 Thr-187/Pro-188（ACGCCC）轉為Met-187/Ile-188（ATGATC），然后轉染膽管癌細胞系TFK-1和HuCCT-1，引起表達p27 kip1蛋白的UPP降解通路受阻，p27 kip1蛋白大量堆積導致細胞在G0/G1期停留，從而促進腫瘤細胞凋亡及明顯抑制腫瘤細胞增殖。

5 結語

UPP是高效、廣泛、有選擇性的蛋白質降解途徑，參與細胞周期調節、信號轉導、轉錄調控、免疫應答等各種細胞生物學功能，其改變與膽道疾病的發生、發展及治療密切相關，是研究膽道疾病的一個新靶點。胰島素在ACST膿毒癥狀態下具有直接調節免疫炎癥反應的作用，減少炎癥介質分泌，抑制骨骼肌蛋白質降解，其調節機制證實通過對UPP的研究而被了解。膽管腫瘤起病隱匿，預后差，UPP的研究對于闡明發病機制、推動早期診斷及開發分子靶向治療提供了新思路和新策略。

[1]Rohaim A,KawasakiM,Kato R,et al.Structure of a compact conformation of linear diubiquitin[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2012,8(Pt 2):102-108.

[2]Metzger MB,Weissman AM.Working on a chain:E3s ganging up for ubiquitylation[J].Nat CellBiol,2010,12(12):1124-1126.

[3] Yang YL,KitagakiJ,Wang H H,et al.Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy[J].CancerSci,2009,100(1): 24-28.

[4] Schaefer J B,Morgan D O.Protein-linked ubiquitin chain structure restricts activity of deubiquitinating enzymes[J].J Biol Chem. 2011,286(52):45186-45196.

[5]Anwar A,Norris D A,Fujita M.Ubiquitin proteasomalpathway mediated degradation ofp53 in melanoma[J].Arch Biochem Biophys, 2011,508(2):198-203.

[6]Dyson H J,Komives E A.Role ofdisorder in IκB-NFκB interaction [J].IUBMB Life,2012,64(6):499-505.

[7] Ravid T,Hochstrasser M.Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(9): 679-690.

[8]Metzger MB,Hristova VA,Weissman A M.HECT and RING finger families of E3 ubiquitin ligases at a glance[J].J CellSci,2012,125 (Pt3):531-537.

[9] Minter R M,Fan M H,Sun J,et al.Altered Kupffer cellfunction in biliary obstruction[J].Surgery,2005,138(2):236-245.

[10] Gong J P,Liu C A,Wu C X,et al.Nuclear factor kB activity in patients with acute severe cholangitis[J].World J Gastroenterol, 2002,8(2):346-349.

[11] Orellana R A,Suryawan A,Wilson F A,et al.Development aggravates the severity of skeletalmuscle catabolism induced by endotoxemia in neonatal pigs[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2012,302(6):682-690.

[12] Mutsvangwa T,Gilmore J,Squires J E,et al.Chronic metabolic acidosis increases mRNA levels for components of the ubiquitin-mediated proteolytic pathway in skeletal muscle of dairy cows[J].J Nutr,2004,134(3):558-561.

[13] Lin S Y,Chen W Y,Lee F Y,et al.Activation of ubiquitin-proteasome pathway is involved in skeletal muscle wasting in a rat model with biliary cirrhosis:potential role of TNF-α[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2005,288(3):E493-501.

[14] Wang YY,Lin S Y,Chuang YH,et al.Protein nitration is associated with increased proteolysis in skeletal muscle of bile duct ligation-induced cirrhotic rats[J].Metabolism,2010,59(4):468-472.

[15] Sakisaka S,Koga H,SasatomiK,et al.Ursodeoxycholic acid reduces expression of heat shock proteins in primary biliary cirrhosis[J].Liver,2000,20(1):78-87.

[16] 劉棟才,周建平,舒國順,等.膽囊良、惡性病變組織中Ub和cu1-1的表達及其意義[J].中國普通外科雜志,2010,19(2):146-150.

[17] 劉艷雷,王嘉,江雪,等.膽道腫瘤組織中ubiquitin的表達及臨床意義[J].胃腸病學和肝病學雜志,2009,18(7):668-671.

[18] Chuensumran U,Saelee P,Punyarit P,et al.Ubiquitin-specific protease 14 expression associated with intrahepatic cholangiocarcinoma cell differentiation[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011, 12(3):775-779.

[19] AsakiT,Katayose Y,SuzukiM,et al.Adenovirus expressing mutant P27kip1 enhanced apoptosis against cholangiocarcinoma than adenovirus-P27kip1 wild type[J].Hepatogastroenterology, 2004,51(55):68-75.

2013-02-06）

（本文編輯：歐陽卿）

浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2011C33023）

312000 紹興市人民醫院普外科（肝膽外科）

魯葆春，E-mail：lbc111@yeah.net