殼聚糖及其衍生物在牙周病學中的應用進展

陳琴男 趙翚

●綜 述

殼聚糖及其衍生物在牙周病學中的應用進展

陳琴男 趙翚

殼聚糖在自然界中來源豐富，價格低廉，且具有較好的生物活性、生物相容性、生物降解性，并易于制成溶液、膜、膠體等各種劑型[1]，在醫學領域被廣泛應用。殼聚糖及其衍生物因具有抑菌性、可做緩釋藥物的載體、能促進牙周組織的生長和修復、骨再生等特性，在牙周病學領域越來越被關注。現對殼聚糖及其衍生物在牙周病學中的應用進展作一綜述。

1 殼聚糖及其衍生物的生物基礎研究

1.1 生物相容性和降解性 殼聚糖是從自然界甲殼類動物外殼中的甲殼素 [B-（1-4）聚-2-乙酰胺基-D-葡糖]脫乙酰化制得，殼聚糖通過溶菌酶代謝后成為無毒的D-氨基葡萄糖,作為一種抗菌酶存在于人類唾液中。已有文獻報道，殼聚糖具有良好的性質如生物黏附性、通透性、生物相容性和生物降解性[2-4]。

Peh等[2]使用醋酸和乳酸溶液方法制備醋酸化殼聚糖和乳酸化殼聚糖，并用紋理分析儀檢測醋酸化殼聚糖、乳酸化殼聚糖的機械強度和體外黏附強度。乳酸化殼聚糖比醋酸化殼聚糖表現出更低的抗拉強度，但更加柔軟、生物黏附性能更強。乳酸化殼聚糖無刺激性，不會導致皮膚過敏反應，進行血液注射測試也無明顯的不良反應。但醋酸化殼聚糖可造成皮膚不良反應，如出現紅斑、水腫及系統毒性。因此，Peh等人認為乳酸化殼聚糖膜適合在傷口愈合及皮膚燒傷上的臨床應用。

Dodane等[3]建立caco-2單細胞模型，殼聚糖引起可逆的、時間和劑量依賴性的跨上皮電阻抗的衰減。殼聚糖對緊密連接的作用通過轉運甘露醇增加的滲透系數來證實，當細胞以0.1%～0.5%w/v殼聚糖溶液處理60min后較對照組細胞的滲透系數明顯增加。Vande-Vord等[4]將多孔殼聚糖支架植入小鼠體內，然后于1、2、 4、8或12周后處死動物，組織學檢查顯示：經標記的中性粒細胞積聚在植入的多孔殼聚糖支架中，隨著植入時間的推移，殼聚糖支架逐漸降解；革蘭染色和鱟試劑檢測顯示無感染或產生內毒素的證據；殼聚糖孔隙內可見膠原蛋白，表明結締組織基質沉積在殼聚糖支架內；外部植入物多孔殼聚糖支架表面也觀察到相關的血管生成活性。這一研究表明，殼聚糖在動物模型上具有高度的生物相容性和生物降解性。

1.2 抑菌性 有學者報道，殼聚糖對大部分口腔病原體有抗菌性包括牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、放線伴放線桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、綠膿桿菌[5-8]。雖然殼聚糖如何顯示出具體的抗菌作用還不清楚，可能原因在于殼聚糖的質子化作用和積極吸引帶負電荷的細菌細胞壁。兩項功能之間的相互作用導致細菌細胞壁破裂，細胞質泄漏，最終導致細菌死亡。Andres等[9]認為，殼聚糖的抗菌機制是通過其游離氨基酸群體來破壞細胞壁實現的。Chung等[6]發現，殼聚糖對大腸桿菌的滅活通過兩個步驟的順序機制發生：首先是細胞膜和細胞壁的初步分離，其次是破壞細胞膜。Ikinci等[3]發現大分子量的殼聚糖對牙齦卟啉單胞菌抗菌性更強。還有學者發現，分子量越大和殼聚糖的脫乙酰程度越高，殼聚糖的抗菌活性越強[5，10]。然而，增加的脫乙酰程度會引起溶菌酶生物降解的減少。

Chen等[7]對殼聚糖對6株包括3種革蘭陰性和3種革蘭陽性細菌的抗菌活性進行了研究，并且對殼聚糖的抗菌活性與殼聚糖的脫乙酰度、濃度和分子量的相關性進行評估，殼聚糖顯示出對綠膿桿菌固體的瓊脂抗菌活性最高。當細菌被栽培液體發酵液中發現類似的傾向。高脫乙酰度和殼聚糖的濃度高，導致較高的抗菌活性。殼聚糖的分子量的不同對細菌的抑制效果的影響是依賴于細菌的種類。大腸桿菌在其死亡階段和對數的階段對殼聚糖分子量的不同而抗菌效果不同表現明顯。認為殼聚糖的抗菌機制可以通過細菌表面的電荷和細菌和殼聚糖接觸時間的持續性來解釋。No等[10]對殼聚糖的抑菌活性和6種不同分子量的殼聚糖低聚物（Mws）進行測試，殼聚糖顯示出比殼聚糖低聚物更高的抗菌活性，而且明顯抑制大部分受試細菌的增殖，雖然不同分子量的殼聚糖與細菌種類的不同所顯示的抑制效果也不同，0.1%殼聚糖普遍表現出對革蘭陽性細菌比對革蘭陰性細菌更強的抗菌效果。殼聚糖作為溶劑，1%醋酸抑制絕大多數受試細菌生長是有效的，除了乳酸菌，因為1%乳酸或蟻酸能更有效的抑制乳酸菌。殼聚糖的抑菌活性與pH值（pH測試范圍值4.5～5.9）呈負相關，在較低的pH值下殼聚糖的抑菌活性更高。Bae等[11]研究發現，殼聚糖表現出有效抗變形鏈球菌的作用，并在4d的菌斑再生模式中顯示處重要的抗菌和抗菌斑作用。

1.3 作為緩釋抗菌藥物的載體 Bernardo等[12]和Shen等[13]的體外實驗研究表明，殼聚糖可以作為緩釋抗菌藥物的載體。 Tig li等[14]通過制備殼聚糖支架，在支架里載入地塞米松或堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)。在杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（DPBS）里載入900ng地塞米松的殼聚糖支架以一個均勻的速度釋放地塞米松，持續5d全部釋放。bFGF在所有的殼聚糖支架（50ng或100ng）均在10～20h內釋放完。

Tada等[15]的實驗結果表明，殼聚糖膜含有羥基熒光素和熒光紫杉醇載入的PLGA NPs顯示出雙相釋放特性。在釋放的第一相，78%的CF和34%的NPs在短短數日內釋放。在第二相，釋放變得緩慢，其后3周釋放出額外的22%的CF和18%的NPs。掃描電鏡圖像和動態光散射測量表明，NP釋放取決于膜降解率。FPTX-loaded PLGA NPs表明藥物總量的19.8%在2d內釋放，接下來的26d內未檢測到額外的釋放。因此認為，殼聚糖膜具有包含PLGA NPs的能力并形成近乎完美的表面覆蓋層，并且能綜合并釋放兩個有著不同的親水性的藥物，這是一種有前途的局部緩釋藥物釋放平臺。

1.4 成骨作用 Bhat等[16]通過動物實驗觀察殼聚糖在骨再生中的作用。其將從黑豚鼠股骨和大鼠的脛骨培養得到的間充質干細胞播種在殼聚糖微粒上，通過在體外培養干細胞附著的實驗使細胞黏附在微粒上5、10、20、30h，間充質干細胞黏附在微粒上的熒光圖像在24h或48h取得，使用活/死細胞檢測。間充質干細胞/成骨細胞播種在微粒上然后使用成骨媒介進行體外培養，并且植入到部分骨缺損的大鼠股骨上。在體內研究中將大鼠分成實驗和對照兩組，每組4只。實驗組植入以間充質細胞為種子的微粒，并在4和8周分別觀察；對照組只植入支持缺陷的不銹鋼板。股骨在植入4和8周后取出，通過造影、顯微CT、組織學來評估骨缺損位點的骨形成。實驗組在植入8周后觀察到有明顯的骨形成增加。這項研究的結果表明，殼聚糖微粒被證明是一種很好的骨再生的生物材料。

Yeo等[17]的動物實驗發現殼聚糖膜可以使牙骨質和牙槽骨再生。Jung等[18]將酸和聚乙醇酸植入大鼠顱骨缺損上，殼聚糖膜手術植入在第2、8周局部骨形成得到加強。因此得出殼聚糖膜涂以聚乙醇酸有一個重要的潛能導致大鼠顱骨缺損模型的骨形成。但聚乙醇酸的劑量范圍和觀察間隔對骨形成無明顯差異。Pramanik等[19]將一種新的生物模擬羥基磷灰石/殼聚糖磷酸鹽納米復合體用一種溶液為基礎的化學方法合成，其中的羥基磷灰石的含量為10%～60%（w/w），羥基磷灰石和磷酸化殼聚糖的界面粘合，通過傅里葉變換紅外吸收光譜分析和X射線衍射研究。復合材料的表面形態及納米粒子在聚合體基質的均勻分散進行了研究，分別通過掃描電子顯微鏡、透射電鏡來研究。發現隨著羥基磷灰石在納米粒子中的含量提高，復合材料的機械性能有了極大改善。通過對小鼠L929成纖維細胞進行了細胞毒性試驗，確認了納米復合材料的細胞相容性。小鼠成骨細胞初步培養研究證明，納米復合材料的骨細胞相容性和很高的體外成骨性。磷酸化殼聚糖的使用促進了復合體基質內微粒的均勻分布，通過懸吊的磷酸鹽組團與微粒復合體之間的界面相互作用。這種由單一的微結構組成的生物模擬羥基磷灰石/殼聚糖磷酸鹽納米復合體可用于骨組織工程。

1.5 屏障膜作用 臨床上采用屏障膜阻止牙齦組織增長遠離根面，為有缺陷的組織提供了一個孤立的空間區域，使得相對較慢增長的牙周韌帶成纖維細胞重新增殖到牙根面。Kuo等[20]使用3種類型的殼聚糖膜（Chi-NaOH、Chi-Na5P3O10和Na2SO3），在標準化、成骨的和臨界成年大鼠頭骨缺陷區覆蓋了特別準備的殼聚糖膜。4周后觀察到骨愈合程度殼聚糖膜組與對照組有明顯的不同。殼聚糖的覆蓋區域顯示結締組織和骨組織邊界間有一個清晰的空間。顯然，這個過程對細胞阻塞和對骨組織成骨是有益的。對照組骨缺損區充滿了結締組織，觀察到其對完整的新骨形成破壞。

牙周膜細胞在牙周組織的再生中起到至關重要的作用，而且未分化的間充質細胞亞群被認為是存在于人群中的。Inanc等[21]進行了體外實驗，將牙周韌帶成纖維細胞(hPDLFs)封裝在350～450μm范圍的殼聚糖/羥基磷灰石微球內，其目的是評估人hPDLFs封裝在殼聚糖羥基磷灰石微粒（C/HA）中這種三維成骨培養環境下的成骨分化潛能。結果證明，hPDLFs在體外誘導，不管是二維還是三維培養條件下，都具有成骨細胞分化能力。在微重力生物反應器里的C/HA微粒可能成為作為一個合適的三維環境以支持hPDLFs的體外成骨分化。

2 殼聚糖及其衍生物在牙周病治療中的應用

Boynuegri等[22]將20個慢性牙周炎患者隨機分為4組：殼聚糖凝膠組（1%w/v）、殼聚糖凝膠（1%w/v）+脫礦的骨基質組、殼聚糖凝膠（1%w/v）+膠原膜組、只接受翻瓣術組（對照組），通過術前及術后90、180d臨床和影像學檢測發現，3組臨床檢測指標無明顯差異，但影像學檢測提示除了對照組其他組有明顯的差異；與術前比較，不管是使用殼聚糖、殼聚糖與脫礦的骨基質、還是殼聚糖與膠原膜的復合物都是有前景的牙周再生材料。Aklnclbay等[23]的研究顯示，對慢性牙周炎患者，在牙周基礎治療后（包括刮治和根面平整），用殼聚糖膠體的濃度（1%w/w）含有或不含有15%的甲硝唑作為牙周局部用藥，殼聚糖本身和殼聚糖與甲硝唑的聯合制劑是一樣有效的，原因系殼聚糖本身具有抗菌特性。

3 結語

殼聚糖及其衍生物生物學特性良好，在牙周病學領域將有很好的應用前景。由于殼聚糖在牙周疾病的治療中大多處于實驗室和動物實驗研究階段，相信在不久的將來，依靠多學科聯合應用，將能以一種合適的藥物配比和劑型應用于臨床，并實現規模化的臨床應用。

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2012-06-18）

（本文編輯:歐陽卿）

溫州市醫藥衛生科學研究項目（2011B018）

325000 溫州醫學院溫州市第三臨床學院（溫州市人民醫院）

趙翚，E-mail：wzzh009@163.com