結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究進展

王麗

（重慶市公共衛生醫療救治中心，重慶 400036）

耐多藥結核（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）是指至少同時對異煙肼和利福平兩種一線抗結核藥物耐藥者。MDR-TB的治療周期較長，治療費用是普通結核患者的幾十倍甚至幾百倍，患者需要承擔巨大的經濟壓力，更為危險的是其傳染性將使感染者也成為MDR-TB患者，這將給公眾健康造成巨大的威脅。

氟喹諾酮類藥物與其他抗結核藥物聯合應用治療結核病有20余年。臨床已有較多報道證明含氟喹諾酮類藥物的化療方案對初治肺結核的良好療效，對MDR-TB的治療也具有一定的治療效果。在世界衛生組織（WHO）制定的《耐藥結核病規劃管理指南》（2008）中把抗結核藥物分為5組，第1組為一線口服抗結核藥物，第2組為注射用抗結核藥物，第3組為氟喹諾酮類藥物，第4組為口服抑菌二線抗結核藥物，第5組為MDR-TB治療中療效不確切的抗結核藥物。抗結核的氟喹諾酮類藥物包括左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星，其抗結核作用從大至小依次為莫西沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星。

氟喹諾酮類藥物的主要優點是胃腸道易吸收，消除半衰期較長，組織穿透性好，分布容積大，毒副作用相對較小，適合于長程給藥。在治療肺結核中具有良好的藥物動力學特性，且大多表現出很好的口服生物利用度，其最大血漿濃度遠遠超過結核分枝桿菌的最低抑菌濃度（MIC）。大多數氟喹諾酮類藥物的抗結核活性與異煙肼、對氨基水楊酸、鏈霉素相當，即使對異煙肼、對氨基水楊酸、鏈霉素耐藥的結核桿菌對氟喹諾酮類仍很敏感，且二者無交叉耐藥性。由此可見氟喹諾酮類在治療MDR-TB中具有舉足輕重的作用。

但是，隨著氟喹諾酮類藥物在治療MDR-TB中的應用日益廣泛，結核分枝桿菌對其耐藥性逐漸增加，特別是當不合理用藥時更易發生。廣泛耐藥結核（extensively-drug resistant tuberculosis，XDR-TB）于2006年3月首次發現。XDR-TB在耐異煙肼和利福平基礎上，對兩種最主要的二線抗結核藥物注射劑以及氟喹諾酮類藥物也耐藥。因此，研究其耐藥機制、加強合理應用以控制耐藥性的增長是非常有必要的。

1 氟喹諾酮類藥物耐藥現狀

由于二線抗結核藥物的MIC與判定耐藥的臨界值較為接近，對于氟喹諾酮類等二線抗結核藥物的藥敏檢測難度較大，國際上尚未制定統一的判定標準，因此目前全球范圍內尚無氟喹諾酮類治療MDR-TB的耐藥監測數據，但是研究者們也在努力，一些小樣本量的研究數據時有報道。

印度的1項MDR-TB耐藥監測顯示，僅對異煙肼和利福平耐藥的MDR-TB對環丙沙星和氧氟沙星均敏感，對異煙肼、利福平、鏈霉素及乙胺丁醇4種藥物全部耐藥者對環丙沙星和氧氟沙星的耐藥率分別為16%和10%[1]。菲律賓的耐藥情況最嚴重，在MDR-TB中，耐2種藥物者對氟喹諾酮類的耐藥率為18.2%，耐3種藥物者為23.3%，耐4種或5種藥物者為53.4%。因此，為減輕抗菌藥物選擇性壓力，在菲律賓的臨床指南中不推薦氟喹諾酮類用于社區獲得性肺炎的治療[2]。

Huang TS等[3]研究了結核分枝桿菌對氟喹諾酮類的耐藥性。他們把收集的菌株分為3組：對一線抗結核藥物敏感的菌株、MDR-TB菌株及其他聯合用藥耐藥的菌株。結果發現MDR-TB菌株中出現的耐氟喹諾酮類菌株增加的趨勢明顯，1995-1997年組的菌株耐藥率為 7.7%，1998-2000年組的耐藥率則上升到22.2%，環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星之間還出現了交叉耐藥性。

崔振玲等[4]對結核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星3種臨床常用的氟喹諾酮類藥物的敏感性進行分析研究。該研究采用液體培養基聯合四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）行抗結核藥物的MIC檢測。對不同結核病患者的163株臨床分離株進行氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星3種藥物的MIC檢測和Bactec MGIT 960藥敏檢測。結果163株菌株中氧氟沙星耐藥株占35.6%；MDR-TB菌株中，氧氟沙星耐藥率為73.5%，MDR-TB菌株中左氧氟沙星耐藥率超過一半以上；所有結核菌株莫西沙星的MIC值均≤1μg/mL。由此可見目前在結核桿菌臨床分離株中，氧氟沙星和左氧氟沙星已出現較高的耐藥率，值得引起臨床醫生的重視，莫西沙星在MDR-TB中顯示出良好的抗菌效果，給MDR-TB的治療帶來希望。

2 耐藥檢測方法

結核桿菌生長周期長，傳統的藥敏檢測方法以培養為基礎，通常需要1個月左右才能得到結果，比較費時。因此耐藥基因的檢測受到研究者的青睞。Bravo LT等[5]采用焦磷酸測序技術檢測氟喹諾酮類的耐藥基因型，氟喹諾酮類耐藥株gyrA基因突變率為85%。

Devasia RA等[6]用比例法、分枝桿菌生長指示管檢測法、顯微鏡觀察法和硝酸還原酶測定法探討了氟喹諾酮類的交叉耐藥性。氧氟沙星耐藥菌株同時采用4種方法測定環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星的敏感情況。結果顯示797株分離菌株中，19株（2.4%）對氧氟沙星耐藥，所有19株氧氟沙星耐藥株均對環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星耐藥。分枝桿菌生長指示管檢測法、顯微鏡觀察法和硝酸還原酶測定法3種藥敏測試方法均有敏感特異性，且較比例法更快速。

3 氟喹諾酮類藥物耐藥原因分析

3.1 基因突變

氟喹諾酮類藥物主要作用于結核分枝桿菌的脫氧核糖核酸（DNA）回旋酶（拓撲異構酶Ⅱ）。DNA回旋酶是由2個A亞基和2個B亞基構成的四聚體，分別由gyrA和gyrB基因編碼，形成具有催化活性的GyrA2GyrB2絡合物，gyrA基因突變主要集中在一個較小的區域，將這一基因區域稱為喹諾酮耐藥決定區（quinolones resistance determining region，QRDR）。結核分枝桿菌耐藥機制主要為基因突變，實驗室研究證明gyrA基因上單一的錯義突變與低水平氟喹諾酮類耐藥有關，而高水平耐藥一般在gyrA基因上發生兩個錯義突變，或者一個為gyrA突變，另一個為gyrB突變。

結核分枝桿菌對氟喹諾酮類產生自發突變率很低，且各品種間大致相同，為1/106～ 1/107。耐藥幾乎全發生在染色體上，只有個別報道發生在質粒上。所有耐藥株的MIC增加2～32倍。國內外很多研究者從分子水平對氟喹諾酮類在治療結核病中產生耐藥的機制作了研究[7]。Cheng AF等[8]研究發現6種主要的氟喹諾酮類之間出現交叉耐藥性主要是由結核桿菌回旋酶A亞單位基因突變導致的。趙蘭等[9]的研究發現81.5%的氟喹諾酮類耐藥菌株gyrA基因在QRDR區域發生突變，而且其特異性很高，因此可以通過檢測gyrA基因的突變預測菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥表型。

趙偉杰等[10]探討了莫西沙星與左氧氟沙星對結核分枝桿菌的交叉耐藥性及耐藥基因突變位點，研究表明莫西沙星和左氧氟沙星為不完全交叉耐藥；gyrA基因90位、94位密碼子是耐藥基因突變位點，低耐藥與高耐藥的突變氨基酸種類有差別。

Von Groll A等[11]研究了結核菌株對氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的耐藥性，并檢測了gyrA或gyrB基因突變情況。結果40株菌株對氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥，只有1株菌株在gyrB的Asn533Thr突變，可見高耐藥與多重突變有關。

盧旺達地區的研究人員發現氧氟沙星耐藥菌株有 gyrA、Thr80Ala、Asp94Ala突變，其 MIC 增加2～ 8倍[12]。Aubry A等[13]研究發現氧氟沙星耐藥與GyrB N510D突變有關，一些GyrA T80A和A90G同時突變的菌株卻對氧氟沙星和其他氟喹諾酮類高度敏感。Matrat S[14]等發現GyrA G88C突變和新的GyrA G88A突變導致了氟喹諾酮類耐藥，但是耐藥程度取決于R6和R7殘基取代后的氟喹諾酮類結構。

全球許多地區都出現了耐氟喹諾酮類的結核臨床分離菌株。Yin X等[15]研究了中國廣州臨床分離的耐氟喹諾酮類菌株gyrA和gyrB基因的分子特征。每株菌株的表型敏感性通過絕對濃度法和QRDR的gyrA和gyrB基因DNA直接測序法測定。73.3%的左氧氟沙星耐藥株在gyrA上有突變，單一密碼子突變有 6個位點（H70R，A90V，S91A，D94G，D94A或D94N），還有雙位點突變 A90V和D94A，在60株 LVX耐藥株中，只有1株是 gyrB T511N突變。研究結果證實了gyrA基因90、91、94位點突變是主要的氟喹諾酮類耐藥機制。

3.2 其他耐藥機制

目前的研究表明gyrA突變是氟喹諾酮類耐藥的最主要因素，其他可能導致耐藥的因素有QRDR之外的gryA或gyrB突變；細胞壁對藥物的滲透性降低；藥物被泵排出，使得胞內藥物濃度不能有效抑制或殺滅分枝桿菌；藥物的隔離或藥物失活。Von Groll A等[11]研究發現1株菌株在gyrA和gyrB基因上無突變，但是對氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥，推測可能是基因突變區在檢測區之外或者是分子改變，減少了細胞內藥物濃度。

3.3 抗結核治療中氟喹諾酮類藥物的使用

Xu P等[16]調查研究了中國上海結核病人中氟喹諾酮類的耐藥情況。605例肺結核病人中，表型氟喹諾酮類耐藥分離株gyrA突變率為81.5%，對一線藥物全敏感的菌株gyrA突變率為1.9%，耐多藥菌株為25.1%，氟喹諾酮類耐藥與至少1種一線抗結核藥物耐藥有關，也與用氟喹諾酮類治療結核有關。在抗結核治療中使用氟喹諾酮類更容易導致復治病人對氟喹諾酮類的獲得性耐藥。

臺灣的研究者[3]對1995-2003年臺灣醫療衛生機構內結核分枝桿菌對氟喹諾酮類的耐藥趨勢作了回顧性分析，發現只有MDR-TB分離株使氟喹諾酮類的MIC增加，結果顯示在MDR-TB治療中使用氟喹諾酮類與其耐藥具有相關性，而與氟喹諾酮類在其他感染性疾病治療中的使用無關。Wang JY等[17]研究發現氟喹諾酮類耐藥與一線抗結核藥物耐藥有關，也與既往結核治療史有關，而與氟喹諾酮類的使用無關。28株氟喹諾酮類敏感株和8株氟喹諾酮類耐藥株gyrA、gyrB上無突變。臨床分離株氟喹諾酮類的耐藥率為3.3%，分離的MDR-TB菌株對氟喹諾酮類的耐藥率為19%。對一線藥物耐藥的菌株更容易對氟喹諾酮類耐藥，這種關系在MDR-TB中更加明顯。氟喹諾酮類藥物在耐藥病人或不能耐受一線抗結核藥物時仍然使用。但是Webster D等[18]研究發現有氟喹諾酮類既往用藥史的患者比未使用過氟喹諾酮類的患者更容易耐藥。

研究者調查了美國大量人群中氟喹諾酮類藥物的耐藥趨勢及危險系數[19]。采用瓊脂比例法確定氟喹諾酮類藥物是否耐藥，氧氟沙星耐藥界限為2 μg/mL。640 例患者中，116 例（18%）在診斷前 12個月有氟喹諾酮類用藥史。16例（2.5%）對氟喹諾酮類耐藥。在54例氟喹諾酮類用藥超過10天的患者中，7例（13%）對氟喹諾酮類耐藥。雖然氟喹諾酮類耐藥率相對較低，但是診斷前超過10天的氟喹諾酮類用藥史與其耐藥有關，診斷前超過60天的氟喹諾酮類用藥史，則耐藥風險最大。Long R等[20]發現單個的氟喹諾酮類處方與氟喹諾酮類耐藥無關，多聯的氟喹諾酮類處方與氟喹諾酮類耐藥有關。

4 結論

目前的文獻報道中，各個國家和地區的結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率存在較大的差異，這個差異可能與檢測方法、菌株的來源、樣本量的大小有關。在氟喹諾酮類耐藥率較高的地區，對臨床分離的結核菌株應進行常規的藥敏檢測，尤其是對耐藥菌株、有結核病史或使用過抗結核藥物者。目前報道的基因突變率存在差異，氟喹諾酮類的耐藥機制還沒有完全清楚，gyrA基因突變不能完全預測是否對氟喹諾酮類藥物表型耐藥。耐藥分為基因型耐藥、表型耐藥、臨床耐藥，基因型耐藥不一定有表型耐藥，表型耐藥不一定有臨床耐藥。基因突變和耐藥表型并非一一對應，只能作為快速檢測的輔助手段。傳統的結核分枝桿菌藥敏試驗為表型耐藥檢測方法，建立在結核分枝桿菌的培養基礎之上，需要4～6周時間，不能滿足臨床治療的需要。基因突變的檢測可以預測菌株對氟喹諾酮類的耐藥表型。而篩選gyrA基因突變來檢測氟喹諾酮類的耐藥性，依賴于研究位點和采樣、氟喹諾酮類的耐藥流行情況和研究設計方案。

因此目前還不能把基因檢測作為一種常規手段來預測結核分枝桿菌對氟喹諾酮類的耐藥性。WHO推薦的經典的氟喹諾酮類藥敏試驗方法為比例法，這種以培養為基礎的傳統藥敏檢測方法雖然費時費力，但是其結果可信度較高，可以為臨床醫生選擇藥物時提供有力的參考，目前也有液體培養的快速培養方法可以縮短時間。但是目前常規藥敏試驗中只有左氧氟沙星，建議同時開展其他幾種氟喹諾酮類的藥敏試驗，為MDR-TB患者提供準確的用藥依據。臨床醫生更加需要重視合理用藥，避免耐藥的進一步發生。

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