低氧與肺癌的研究進展

李雪冰 綜述 尤嘉琮 周清華 審校

肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的腫瘤。全球每年大約有160萬的肺癌新發病例和140萬的肺癌死亡病例[1]。在美國肺癌的發病率在所有惡性腫瘤中位列第2位，而死亡率列第1位[2]。根據衛生部2012年度腫瘤登記年報資料[3]顯示，我國2009年肺癌發病率為53.57/10萬，死亡率為45.57/10萬，即每年新發肺癌患者超過70萬，死亡超過60萬。

已有的研究[4,5]表明，肺癌發病原因與多種基因的突變密切相關，其中最為重要和典型的是抑癌基因p53的突變和原癌基因K-ras的突變。此外，約有40%-50%的肺腺癌中存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的異常高表達或激活突變，并且與較差的預后相關聯[6,7]。與非吸煙人群相比，p53和K-ras的突變比例在吸煙人群中略高；而EGFR的突變比例在非吸煙人群中遠高于吸煙人群[8]。因此，以這些基因作為靶點尋找治療肺癌的方法具有很強的可行性。此外，還有一種重要的腫瘤微環境因素-低氧（hypoxia），對肺癌的發生發展具有重要的作用。因此，本文將近年來低氧與肺癌相關性的研究進展綜述如下。

1 低氧的概念

腫瘤是非單一細胞的實體，從總體上看包括腫瘤細胞和間質，而間質又主要包括血管、淋巴管、結締組織、炎癥細胞和細胞外基質等。此外，可溶性分子O2還參與腫瘤細胞附近的間質動態變化，促進腫瘤的惡性化[9]，他們共同組成了腫瘤的微環境。機體各組織器官的氧分壓明顯低于標準大氣壓160 mmHg，且各器官并不同，其中由高到低分別為：肺110 mmHg，脾66 mmHg，心25 mmHg，腎25 mmHg，腦24 mmHg，肝24 mmHg[10]。低氧是指可利用氧的減少或氧分壓降至臨界值以下的狀態，這種狀態會限制甚至終止器官、組織和細胞的生理功能[11]。低氧可以由多種因素造成[11]，而低氧常發生在急慢性血管性疾病、肺部疾病和腫瘤中[12]。

2 肺癌低氧微環境的發現

其實，早在50多年前，Thomlinson和Gray[13]就在距血管180 μm的地方觀察到了腫瘤壞死，他們推測這是腫瘤細胞過度增殖使其將血氧完全耗盡的位置，這是人類首次開創性地觀測并推斷了腫瘤低氧微環境的存在。此后，H?ckel等[14]也利用氧電極在頭頸部、頸椎腫瘤和乳腺癌中發現了低氧存在，并且與腫瘤患者的低存活率和腫瘤的高轉移性均具有相關性。后續的研究[15]發現，放療過程中氧氣可以被激發而產生自由基，殺傷腫瘤細胞，但處于低氧區的腫瘤細胞由于缺乏氧氣，自由基產生較少，從而對放療產生抵抗作用。直到2006年，Le等[16]才在肺癌患者體內檢測到了肺癌組織低氧氣分壓的存在，并且與較差的預后相關，這是迄今為止唯一關于檢測到肺癌組織低氧的報道。

3 低氧的信號通路

隨著研究的深入，人們發現低氧會通過一個能夠感受并應對低氧的重要轉錄因子-低氧誘導因子（hypoxia inducible factor, HIF），對腫瘤產生多方面的影響。HIF是由Semenza等[17]在研究低氧加速紅細胞成熟時發現的。它是一個由受氧調節的α亞基與穩定表達的β亞基組成的異源二聚體。在常氧條件下，HIF-α蛋白上兩個關鍵位置的脯氨酸會被脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain,PHD）羥化，使其可被希佩爾·林道病基因產物（product of von Hippel-Lindau gene, pVHL）識別并結合，進而被pVHL降解復合物泛素化降解；而在低氧條件下，PHD活性受到抑制，HIF-α無法被羥基化，從而無法被pVHL識別、結合并介導降解，HIF-α便會大量積累，結合HIF-1β，入核發揮轉錄因子的功能，在腫瘤的血管生成、細胞生存、增殖、凋亡、轉移、浸潤和代謝等方面發揮重要的作用。而在2009年HIF也被發現在肺癌組織中轉錄水平上高表達，并且與較差的預后相關聯[18]。此后，越來越多的研究[19]證明低氧和HIF有可能成為治療肺癌的一個十分重要的靶點。

4 低氧信號通路對肺癌的作用

低氧可以通過減少自由基產生，從而對肺癌的放療產生抵抗作用。而低氧對肺癌的影響遠不止這些，Minakata等[20]發現在EGFR突變的非小細胞肺癌中，低氧可以通過上調轉化生長因子（transforming growth factor alpha, TGF-α）來激活野生型EGFR，從而使肺癌細胞產生對吉非替尼的耐藥性；Ouyang等[21]還發現低氧可以上調骨膜蛋白（periostin）的表達，通過激酶Akt/PKB信號通路提高肺癌細胞的生存能力。其實，低氧相關信號分子如低氧誘導因子HIF、脯氨酸羥化酶PHD和希佩爾·林道病基因產物pVHL均會通過多條途徑對肺癌的發生發展產生影響而發揮更加重要的作用。

4.1 HIF對肺癌的作用 HIF由α和β兩個亞基組成。在哺乳動物中，HIF-α存在三種亞型，HIF-1α和HIF-2α在結構和功能上相似性較大，而HIF-3α研究較少，有報道[22]認為它可能作為HIF-1α和HIF-2α的負調控元件。HIF-1α在幾乎所有類型的細胞中均有表達，而HIF-2α和HIF-3α的表達則具有一定的組織局限性[23]。研究表明，低氧可以通過HIF-1α或HIF-2α對肺癌產生重要影響。

4.1.1 HIF在肺癌組織中高表達 早在1999年Zhong等[24]通過大量的免疫組化染色實驗發現，HIF-1α在19種腫瘤的13種中呈現高表達，其中包括肺癌。2000年Volm等[25]在96例非小細胞肺癌標本中對HIF-1α和HIF-1β進行了免疫組化染色，他們發現HIF-1陽性患者的平均存活時間明顯高于HIF-1陰性患者，提示與較好的預后有關聯。2001年Giatromanolaki等[26]應用免疫組化染色對HIF-1α或HIF-2α進行的檢測，結果顯示二者分別在62%和50%的非小細胞肺癌病例中高表達，并且與多種血管生長因子的表達呈正相關。但與之前的報道相反，他們發現HIF-1α與較差的預后相關聯。2009年Yohena等[18]通過實時熒光定量PCR手段在肺癌組織中發現了HIF-1α在轉錄水平上的高表達，這與之前報道的蛋白水平結果相一致，同時他們也發現HIF-1α與較差的預后密切相關。

4.1.2 HIF對肺癌細胞增殖和凋亡的影響 2006年Zhang等[27]在肺腺癌A549細胞中外源性地表達了HIF-1α，他們發現，與對照細胞相比表達HIF-1α的A549細胞可以通過上調多藥耐藥基因MDR-1，抵抗由5-氟尿嘧啶誘導的細胞凋亡。Kamlah等[28]在LLC1肺腺癌模型小鼠中，利用頸靜脈siRNA注射技術，同時沉默HIF-1α和HIF-2α的表達，發現進行基因沉默的肺癌模型小鼠存活時間明顯增長，并且免疫組化顯示腫瘤的增殖明顯減慢，血管生成和凋亡也都明顯減少。同年，Chen等[29]從大量的非小細胞肺癌組織標本出發，發現了HIF-1α與凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族成員蛋白survivin表達的正相關性，并在細胞實驗中發現，HIF-1α可以在轉錄水平調節survivin的表達，從而抑制肺癌細胞的凋亡。HIF-1α在小細胞肺癌中的作用是由Wan等[30]報道，他們通過直接低氧、基因過表達和基因沉默三種手段改變HIF-1α的表達，并進行基因表達譜分析，發現HIF-1α可以促進細胞因子信號傳導抑制蛋白-1（suppressor of cytokine signaling, SOCS1）基因的表達，而SOCS1可以促進小細胞肺癌NCI-H446細胞的凋亡并抑制其生長。這一結果首次揭示了HIF-1α在小細胞肺癌中的特殊調節機制，即通過SOCS1基因對自身的促癌作用進行負反饋調節。Mazumdar等[31]也利用K-ras（G12D）肺癌小鼠模型，揭示了HIF-2α的兩面作用，他們提出HIF-2α不僅能夠促進肺癌的發展，還能通過調節抑癌基因，發揮抑制肺癌的作用。以上這些報道表明，HIF在低氧加速肺癌進程的過程中發揮著十分重要的作用。

4.1.3 HIF在肺癌細胞侵襲轉移中的作用 2007年Shyu等[32]在利用不同侵襲能力的配對肺癌細胞系CL1和CL1-5研究HIF-1α的表達時發現，HIF-1α僅在高侵襲能力的CL1-5細胞系中表達，并且沉默HIF-1α表達后可以明顯降低其侵襲能力。深入的研究發現，HIF-1α可以通過上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）MMP1和MMP2的表達來促進肺癌細胞的侵襲。Li等[33]在2009年利用94例非小細胞肺癌標本進行免疫組化染色分析，發現HIF-1α、HIF-2α與CC趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7,CCR7）的表達呈現正相關性，而深入的細胞實驗結果顯示，HIF-1α和HIF-2α可以正向調節CCR7的表達，而CCR7又可以通過促進激酶ERK的磷酸化來促進肺癌細胞的遷移。2010年Jacoby等[34]利用兩株非小細胞肺癌細胞模型和兩株小細胞肺癌細胞模型，在裸鼠中進行了實驗，發現用HIF-1α的拮抗劑PX-478對小鼠進行灌胃處理，可以明顯抑制原位腫瘤的生長和縱隔轉移，并與較好的預后相關。以上研究結果均表明，低氧可以通過HIF促進肺癌侵襲轉移，從而影響肺癌的預后。

4.2 PHD在肺癌中的作用 脯氨酸羥化酶PHD家族有PHD1、PHD2和PHD3三個成員，在低氧和常氧條件下發揮降低抑癌蛋白HIF的作用。2006年Davidson等[35]在肺腺癌A549細胞中發現，可溶性的鎳可以抑制PHD的羥化功能以及PHD與HIF的作用，從而穩定了HIF，此項研究開創性地提出PHD可以作為肺癌治療的靶點。2008年Giatromanolaki等[36]利用73例非小細胞肺癌患者標本進行研究發現，其中的33例標本具有高HIF/PHD表達，而只有18例標本具有低的HIF/PHD表達，這一結果在臨床標本水平提示了HIF的促癌作用和PHD的抑癌作用。2001年Chen等[37]發現調節HIF的關鍵分子脯氨酸羥化酶PHD1、PHD2和PHD3均在62例配對非小細胞肺癌標本的癌組織中高表達。通過與臨床資料和病理結果的相關性分析，發現PHD3的高表達與腫瘤分期較早及分化相關，通過病理切片染色還發現PHD3的高表達與抗凋亡蛋白Bcl-2呈負相關。這一報道提示在非小細胞肺癌中PHD3可能具有潛在的促凋亡功能。2011年Andersen等[38]擴大了樣本量，他們利用335例I期到III期的非小細胞肺癌標本進行組織芯片和免疫組化染色實驗，檢測了三種脯氨酸羥化酶的表達情況，并分析與預后的關系。研究結果顯示PHD1、PHD2和PHD3在肺癌標本中均高表達，并且與較差的預后相關聯，具有高表達PHD的病例5年存活率明顯低于低表達組。這一結果提示脯氨酸羥化酶也可能具有促癌作用。在2012年最新的一項研究中，Chen等[39]應用原位雜交技術和免疫組化染色技術，在26例肺癌標本中檢測了HIF及三種脯氨酸羥化酶的表達情況，其中12例病例伴有慢性阻塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease, COPD），而其余14例為對照組。通過醫學統計學分析得出結論，脯氨酸羥化酶通過調節HIF，在肺癌病例中參與了COPD的低氧肺血管重建過程。

4.3 pVHL在肺癌中的作用 雖然pVHL被證明可以通過泛素化降解途徑下調促癌蛋白HIF而發揮抑癌基因的功能。但是，肺癌方面功能的報道中卻顯示pVHL存在兩方面作用。1997年Corless等[40]率先通過免疫組化染色發現，pVHL主要在肺癌細胞的細胞質有較強的表達。2001年Kamada等[41]發現肺癌H1299細胞中導入外源表達的pVHL，可以穩定肌動蛋白組織裝配，并通過促進黏著斑形成，抑制肺癌細胞的遷移能力，這是首次發現pVHL在肺癌細胞中具有抑癌作用。而最新的研究報道顯示了pVHL的促癌作用。Zhou等[42]的研究發現，在肺腺癌細胞A549中穩定沉默pVHL表達可以明顯降低細胞的成克隆能力和增殖能力，揭示了pVHL同樣可以發揮促癌作用，并且暗示了非HIF依賴的pVHL新功能。

5 結語

從腫瘤低氧微環境最初被發現到現在的60年中，人們已經清楚地了解了它的存在、調節機制和意義及功能。越來越多的研究表明，低氧對各種類型的腫瘤包括肺癌均起到十分重要的作用。低氧誘導因子HIF也已成為肺癌發生發展過程中一個極其重要的調控因子。HIF在肺癌中的高表達與增殖和預后等相關聯，使其可以作為肺癌發生發展和預后的分子標記存在。此外，調節HIF的重要分子PHD和pVHL也在肺癌組織細胞中主要呈現低表達，并發揮重要的功能。這使得低氧、低氧誘導因子以及其調節分子PHD和pVHL成為十分有潛力的肺癌治療靶點。