腫瘤間質比是非小細胞肺癌獨立的預后因素

王兆峰 劉紅兵 趙仁德 張鶴 劉春花 宋勇

近期發表的文獻[1]顯示：2012年肺癌的死亡率仍將處于各種腫瘤首位，新發病例居第二位。在諸多西方國家，近15年肺癌的發病率已達高峰并呈下降趨勢，而我國肺癌的發病率卻呈持續上升趨勢[2]。鑒于肺癌高發病率和死亡率，提高肺癌的診治水平，改善患者預后已成為亟待解決的難題。近年來，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）作為最常見的組織病理類型研究較多。生存相關的研究[3-6]已證實年齡、KPS評分、TNM分期等是NSCLC的獨立預后因素。但是，我們是否可以在進行病理診斷的同時根據組織標本的病理形態表現預測患者的預后呢？Mesker、Wang等[7-11]研究表明：在結直腸癌、乳腺癌、食管鱗癌及食管腺癌等多種實體瘤內，腫瘤組織內腫瘤與間質的比例（tumor-stroma ratio, TSR）被證明是一種新的、可靠的獨立預后因子，且此評估方法簡單，切實可行，重復性好。但TSR對NSCLC患者的預后價值目前尚無相關研究，本實驗旨在證實TSR在NSCLC中的預后價值。

1 材料與方法

1.1 材料 選取南京軍區南京總醫院2000年1月-2007年1月手術切除的經常規病理證實的NSCLC標本73例。73例NSCLC中，男性50例，女性23例；年齡30歲-75歲，中位年齡59歲。所有NSCLC病例術前未經化療和放療，術后病理證實為NSCLC（鱗癌35例，腺癌33例，腺鱗癌5例），術后經過2個-4個療程的以鉑類為基礎的化療。按照UICC分期委員會第7版TNM分期標準，分為I期22例，II期28例，III期23例。

1.2 方法 將術后組織常規石蠟包埋，制片成厚度為4 μm切片。采用蘇木素染色法，按常規程序脫蠟和水化。PBS液沖洗后，用蘇木素（北京中杉金橋公司）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 實驗結果的判定 實驗結果根據參考文獻[7]判定：常規鏡檢蘇木素染色后的切片，50×放大倍數下選取腫瘤浸潤最明顯的區域。常規認為該區域有兩部分組成：腫瘤細胞部分和間質部分，用百分比表示。然后，在該區域內100×倍放大倍數下評估單視野范圍內腫瘤細胞面積所占該視野的百分比（carcinoma percentage, CP），剩余百分比即為間質百分比（例：如果腫瘤細胞面積占該視野40%，間質成分面積所占百分比即為60%。取10%為取值區間，即：20%、30%等），計算腫瘤內部的TSR。選取2個-4個視野進行評估，取CP值最低的一個確定為最終取值。因計算的為腫瘤內部的TSR，故該視野范圍內間質周圍必須是有腫瘤細胞浸潤。不能選取間質較多，間質周圍無腫瘤細胞的區域進行評估。根據TSR評估結果，選取CP為50%的cut-off值，將病例分為兩組：將CP值＜50%病例定義為間質豐富組（stroma-rich group）而CP值≥50%視野定義為間質稀少組（stroma-poor group）。以上評估過程主要由2名病理專家完成，當2名專家意見不一致時根據第32名病理專家的意見確認最終結果。

1.4 隨訪 患者從手術日期開始隨訪，至患者死亡結束，生存者至2012年5月31日終止隨訪。

1.5 統計處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計處理，采用卡方檢驗、Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSR在NSCLC組織中的分布 根據以上試驗方法，在73例NSCLC組織中，間質豐富組27例，間質稀少組46例，比例分別為37%、63%。不同TSR在肺鱗癌及腺癌中病理形態學示例如圖1所示。

2.2 TSR分組與臨床病理參數的關系 根據TSR結果，間質稀少組與間質豐富組在性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理類型及淋巴結轉移及pTNM分期間無統計學差異。結果見表1。

2.3 不同TSR分組與NSCLC預后的關系 73例NSCLC患者從手術日期開始隨訪，至患者死亡結束，未死亡的至2012年5月31日截止隨訪。用Kaplan-Meier生存分析和Logrank檢驗統計分析，TSR兩分組之間OS差異有統計學意義（P=0.014），結果顯示間質稀少組患者中位生存時間為1,169 d，間質豐富組的患者中位生存時間為808 d。間質豐富組的患者OS明顯低于間質稀少組的患者（圖2）。對性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理類型、淋巴結轉移、pTNM分期、分化程度及TSR分組9個因素進行Cox模型多因素分析（表2）可見，TSR是影響NSCLC預后的獨立因素（HR=1.832, 95%CI: 1.017-3.299），pTNM分期也是影響NSCLC獨立預后因素（HR=1.953, 95%CI: 1.284-2.970），而性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、淋巴結轉移及分化程度均非NSCLC預后的獨立因素。

3 討論

本實驗采用蘇木素法對73例NSCLC手術切除標本的TSR進行檢測，根據TSR評估結果，選取CP%為50%的cut-off值，將病例分為兩組：間質豐富組（stroma-rich group）和間質稀少組（stroma-poor group）。統計分析顯示：間質豐富組患者預后明顯差于間質稀少組，兩組OS差異有統計學意義（P=0.014），并證明TSR是NSCLC獨立的預后因子（HR=1.832, 95%CI: 1.017-3.299）。該實驗對TSR在NSCLC中的預后價值做出了評價。

圖 1 TSR在不同病理類型肺組織中的表達。A：鱗癌間質稀少組；B：腺癌間質稀少組；C：鱗癌間質豐富組；D：腺癌間質豐富組（×100）。Fig 1 The expression of TSR in lung tissue of different kinds of histology. A: The stroma-poor group of squamous cell lung carcinoma; B: The stroma-poor group of lung adenocarcinoma; C: The stroma-rich group of squamous cell lung carcinoma;D: The stroma-poor group of lung adenocarcinoma (×100).

圖 2 73例NSCLC患者Kaplan-Meier生存分析。結果顯示間質稀少組患者中位生存時間為1,169 d，間質豐富組的患者中位生存時間為808 d。間質豐富組的患者OS明顯低于間質稀少組的患者（P=0.014）。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis of 73 cases with NSCLC.Results show that the median survival time in the stroma-poor group was 1,169 d, and 808 d in the stroma-rich group. OS days of patients in stroma-rich group were significantly lower than the stroma-poor group (P=0.014). OS: Overall survival.

目前，關于TSR在實體瘤中的預后價值，研究尚少。荷蘭學者Mesker等在前期的研究中發現：在實體瘤內，與腫瘤組織接觸的間質組織可能影響患者的預后。為進一步證實上述現象，Mesker等[7]用HE染色的方法對122例I期-III期的結直腸癌患者手術組織進行病理形態分析及評估，并隨訪患者預后。研究結果發現：選取CP為50%的cut-off值對患者進行分組，CP≥50%組的患者OS和無病生存（disease-free survival, DFS）均長于CP＜50%組。該實驗同時發現，隨著結直腸癌分期的遞進，CP值越小。該實驗結果與本實驗相似，但兩實驗結果統計分析未見TNM分期與TSR有相關性，由于兩實驗樣本量相對較少，需要增加樣本量以進一步研究。為進一步研究TSR在結直腸癌中的價值，Mesker等[10]開展了另一組含135例I期-II期結直腸癌患者的研究，預后分析進一步證實了TSR在結直腸癌中的預后價值。Courrech Staal等[9]對93例食管腺癌術后組織的TSR進行評估并隨訪患者預后，發現CP高組患者的DFS明顯長于CP低組，并證實TSR是食管腺癌獨立的預后因素（HR=2.006, 95%CI: 1.181-3.407）。關于TSR與NSCLC預后的關系，目前尚無相關報道。本實驗結果顯示：通過對73例NSCLC術后組織切片蘇木素染色后發現，間質稀少組患者中位生存時間為1,169 d， 間質豐富組的患者中位生存時間為808 d。間質豐富組的患者OS明顯低于間質稀少組的患者，多因素Cox回歸分析顯示TSR是影響NSCLC預后的獨立因素（HR=1.832,95%CI: 1.017-3.299），與Mesker等以上研究結果相似。本實驗同時證實TNM分期是NSCLC獨立的預后因素，這與以往研究結論一致。

表 1 TSR與不同臨床病理特征間的關系Tab 1 The relationship between TSR and different clinical and pathological features

表 2 NSCLC預后因素多變量Cox回歸分析Tab 2 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in NSCLC

腫瘤組織是由腫瘤細胞和復雜的間質組成。在正常組織內間質具有屏障的作用，但在腫瘤組織內，作為腫瘤微環境的間質成分卻對腫瘤的浸潤轉移有易化作用[12]。新近研究[13,14]表明，在腫瘤演進過程中，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是一個重要的決定性過程，此過程通過多個細胞內通路參與腫瘤細胞侵襲轉移乃至“干細胞性”轉變等病理過程。在癌變的早期，腫瘤細胞的增殖未突破基底膜，與周圍間質隔開，此為原位癌。當原位癌發展成浸潤性癌時，癌細胞穿過基底膜侵犯間質，誘導正常間質轉化為“活性間質”[15]，此過程促進了成纖維細胞的增殖及細胞外基質（extracellularmatrixc, ECM ）的沉積[16]，從而擴充了腫瘤間質。而作為間質重要成分的成纖維細胞，不僅在創傷愈合等多種炎癥反應中起作用，而且是腫瘤的關鍵性特征[17]。近年來，關于一種腫瘤間質內特殊的成纖維細胞-腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fi broblasts, CAFs）因在腫瘤的發生發展中的特殊作用而逐漸得到重視。大部分侵襲性腫瘤的間質都會有CAFs，CAFs具有較強的收縮能力，它可以合成ECM，從而刺激上皮細胞的增值，通過旁分泌不同生長因子及細胞因子，如：肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）、胰島素生長因子（insulin-like growth factors, IGF）、神經生長因子（neuron growth factor, NGF）等，活化后的CAFs可分泌高水平的細胞外金屬基質蛋白酶，從而促進ECM組分的改變，影響上皮腫瘤細胞的演進[18-20]。除了對原發灶腫瘤細胞的作用，Olaso等[21]研究發現在轉移灶內活化的CAFs同樣可以促進腫瘤的增值。Balsamo等[22]發現CAFs還能夠調節免疫細胞功能以使腫瘤細胞獲得免疫逃逸。由以上研究可見，腫瘤組織內的間質成分通過多種通路參與了腫瘤發生、增殖及浸潤轉移的過程，從而影響患者的預后。但CAFs與其它間質成分之間如何相互影響，以及EMT與CAFs之間的確切關系，這些相互作用機制與腫瘤的發生發展之間的確切關系，目前尚未完全清楚。

盡管本實驗對TSR在NSCLC中的預后價值做出了評價，但本實驗也存在一些缺陷，如：本實驗主要研究了NSCLC中常見的鱗癌、腺癌及腺鱗癌等病理類型，但NSCLC分型復雜，僅腺癌就有多種不同分類，形態學差異較大，因此有待于擴大樣本量，完善病理類型，進一步確認實驗結果。

總之，本研究提示通過組織病理形態分析有可能為NSCLC患者預后提供可靠信息，且該方法簡單可行。本實驗同時證實TSR是NSCLC患者獨立的預后因素。但是，關于TSR與NSCLC之間的機制關系尚未完全明確，尚待進一步研究。

致謝

感謝南京軍區南京總醫院病理科涂頻、李萬春醫師在該實驗的實驗方法及實驗結果評定部分中給予的幫助。