PTEN p53及hTERT在Ⅰ型子宮內膜癌中的表達

張桂香，李春輝，齊潔敏，申興斌，莊新榮，馮振波

(承德醫學院附屬醫院婦科，河北 承德 067000)

子宮內膜癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，近年來發病呈上升趨勢。在其發病過程中抑癌基因的失活、突變和癌基因的異常激活發揮著重要的作用，基因的表達產物為蛋白。本研究應用免疫組化法同步檢測子宮內膜癌中PTEN、p53、hTERT三種蛋白的表達，旨在探討三者在子宮內膜癌發生發展中的作用，為子宮內膜癌的早期診斷、判斷預后以及靶向治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料:選擇2011年1月至2012年12月經病理結果證實Ⅰ型為子宮內膜癌而入住我院接受手術治療的患者49例為研究對象，各患者術前均無放化療病史，年齡41－69(53.4±3.6)歲。子宮內膜樣癌 G1期12例、G2期27例、G3期10例。子宮內膜癌手術－病理分期 (按2009年FIGO標準):Ⅰ期34例(ⅠA期15，ⅠB期19例)、Ⅱ期10例，Ⅲ期4例，Ⅳ期1例。取同時間段因子宮肌瘤行子宮切除術的正常子宮內膜49例做對照。

1.2 試劑與免疫組化方法:PTEN鼠抗人單克隆抗體購自北京中山生物技術有限公司，hTERT兔抗人多克隆抗體及p53鼠抗人單克隆抗體購于福州邁新生物工程公司。免疫組織化學操作步驟如下:石蠟包埋組織連續切片4μm貼附于經多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50min;石蠟切片經二甲苯脫蠟及100%、95%、90%、80%的梯度酒精脫水;3%H2O2孵育10min(室溫)封閉滅活內源性過氧化酶;PBS沖洗5min，把切片放入0.01moL/L(pH6.0)枸櫞酸鹽緩沖液進行微波爐抗原修復10min;加正常山羊血清工作液進行封閉，在37℃濕盒中溫育60min;滴加1∶100濃度一抗，37℃濕盒中溫育60min后，在濕盒中4℃過夜;PBS洗3×5min，滴加二抗，室溫孵育15min，再次PBS洗3×5min;取1mL蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，室溫顯色;蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染，封片，觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化結果判斷:(×400)鏡下觀察，依據染色強度和陽性細胞所占比例進行綜合判定。其中染色強度分級:無著色為0分，淡黃為1分，黃或深黃2分，褐或棕黃3分。陽性細胞所占比例判定:陽性細胞計數＜10%為0分，10% －25%為1分，26% －50%為2分，51% －75%為3分，＞75%為4分;兩者相加＜2分為陰性(－)，2－3分陽性(+)，4－5分中等陽性(++)，6－7分強陽性(+++)。結果判定由兩名病理科主任醫師經雙盲法獨立評分。

1.4 統計學處理:數據采用SPSS13.0軟件處理，計數資料進行X2檢驗，等級資料進行秩和檢驗。

2 結果

2.1 PTEN、p53、hTERT在Ⅰ型子宮內膜癌織中的表達:PTEN陽性表達定位于胞質，而hTERT、p53定位于細胞核。表達結果如表1所示。子宮內膜癌組PTEN陽性率為40.8%，且以弱陽性為主，無強陽性表達;而正常子宮內膜組表達強度以陽性及強陽性為主，總陽性率97.9%，差異具有統計學意義(P＜0.01)。p53在子宮內膜癌組有19例(38.8%19/49)為陽性表達，而正常子宮內膜組僅1例(2.0%1/49)為陽性表達，且為弱陽性，二者表達差異具有統計學意義(P＜0.01)。hTERT在子宮內膜癌組陽性率為67.3%，而正常子宮內膜組無表達，差異具有統計學意義(P＜0.01)。

表1 PTEN、p53、hTERT在子宮內膜癌及正常子宮內膜組織中的表達

2.2 PTEN、p53、hTERT三者與子宮內膜癌病理特征的關系:PTEN的陽性表達與子宮內膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉移、肌層浸潤深度呈負相關，即惡性程度越高、期別越晚，其表達越低。相反，p53、hTERT與子宮內膜癌惡性程度、FIGO分期呈正相關。差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 PTEN、p53、hTERT陽性表達與子宮內膜癌病理特征的關系

3 討 論

磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homo-Log PTEN)，是迄今發現的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因［1］，也是人類腫瘤中最易發生突變的腫瘤抑制基因［2］，于1997年首次被報道之后即成為研究熱點，是繼p53基因后另一個較為廣泛地與腫瘤發生關系密切的基因。其表達產物PTEN蛋白作為一種腫瘤抑制因子，通過阻止細胞生長和分裂的速度調控細胞分裂周期及細胞凋亡，因此PTEN蛋白一旦缺失，細胞則可發生異常增生甚至惡性變。另外，PTEN蛋白具有協助控制細胞轉移、細胞與周圍組織的粘附和血管發生的功能，因而與腫瘤的轉移擴散相關。據報道PTEN基因缺失率在子宮內膜癌中最高，32% －55%不等，故被視為子宮內膜的“看家基因”［3］。本研究發現PTEN蛋白在正常子宮內膜組陽性表達率為97.9%，而子宮內膜癌中僅為40.8%，下降了57.1%，非常接近國外報道的基因缺失率最高值;其陽性表達與子宮內膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉移、肌層浸潤深度呈負相關，換言之，隨著腫瘤惡性程度升高及進展，其表達進一步降低。這一結果說明PTEN蛋白的減少與子宮內膜的發生發展相關。

p53是一種抑癌基因，但極易發生突變，故分為野生型和突變型兩種。其中野生型p53基因是一種抗癌基因，其表達的p53蛋白的半衰期很短，用免疫組化方法不易檢出。而突變型p53基因失去了修復DNA和誘導細胞凋亡的能力，致使細胞過度增殖、凋亡減少以及細胞轉化，促進惡性腫瘤的發生和發展［4，5］。其表達的突變型p53蛋白的半衰期延長，穩定性高，在細胞核內積聚，可用免疫組化方法檢測到。以此推斷本研究所測出的p53蛋白為突變型。本研究結果顯示在正常子宮內膜組變異型p53蛋白僅1例(2.0%)表達為弱陽性，子宮內膜癌組陽性表達率升高至38.8%(19/49)，并與子宮內膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉移呈正相關，這一結果與上述理論基礎相符。但用同一理論則無法解釋突變型p53蛋白與肌層浸潤深度無關的實驗結果，這可能與樣本較小有關，也可能與突變型p53蛋白在子宮內膜癌發展中的作用機制有關，有待進一步研究證實。

人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)被認為是端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活性表達的關鍵組分和限速因子［6］。而端粒酶的激活是細胞獲得永生化和(或)惡性變的重要機制。因此hTERT對細胞增殖、衰老、永生化及癌變起重要作用。本研究結果顯示正常子宮內膜組無hTERT表達，而子宮內膜組陽性表達率為67.3%，且42.9%為一般陽性及強陽性表達。其陽性表達率與子宮內膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉移、肌層浸潤均呈正相關(P＜0.05)。然而國外研究表明hTERT在子宮內膜癌組織中陽性表達與子宮內膜癌的組織分級相關，與FIGO分期無關［7］。也有研究顯示子宮內膜癌組織hTERT強陽性表達率為80%－90%，且與子宮內膜癌肌層浸潤及臨床分期呈正相關。雖然各家的報道不盡相同，但hTERT在子宮內膜癌中高陽性表達率以及與組織分級呈正相關的觀點基本一致，這表明hTERT可作為子宮內膜診斷及判定預后不良的標記物應用于臨床。與正常子宮內膜相比，PTEN在子宮內膜癌中表達減少，而p53及hTERT呈表達升高，三者均可作為子宮內膜診斷及判定預后的標記物。

［1］Erkanli S，Kayaselcuk F，Kuscu E，et al.Expression of survivin，PTEN and p27 in normal，hyperplastic，and carcinomatous endome －2 trium［J］.Int Gynecol Cancer，2006，16(3):1412 －1418.

［2］Mirantes C，Eritja N，Dosil MA，et al.An inducible knock－out mouse to model cell－autonomous role of PTEN in initiating endometrial，prostate and thyroid neoplasias［J］.Dis Model Mech，2013，2:8.

［3］Li L，Ross AH.Why is PTEN an important tumor suppressor［J］.Cell Biochem，2007，102(6):1368 －1374.

［4］遲元衛，陳健，劉亮等.結腸癌中hTERT和p53蛋白表達及臨床意義［J］.山東大學學報(醫學版)，2011，49(4):115 －117.

［5］Takeda T，Dong X，Take da H，et al.Successful immune therapy combined with hyperthermia therapy for cancer patients［J］.Gan To KagaKu Ryoho，2006，33(12):1739 －1741.

［6］Blackburn E H.Telomere states and cell fates［J］.Nature，2000，408(6080):53－56.

［7］Brustmann H.Immunohistochemical detection of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)，topoisomerase IIalpha expression，and apoptosis in endometrial adenocarcinoma and atypical hyperplasia［J］.Int Gynecol Pathol，200，24(2):184 －192.