轉化生長因子 β 與 microRNAs 的串話效應在心肌纖維化中的研究進展

楊四寶、高永建綜述，楊萍審校

轉化生長因子 β 與 microRNAs 的串話效應在心肌纖維化中的研究進展

楊四寶、高永建綜述，楊萍審校

心臟重構是心力衰竭發生的根本原因，其中心肌纖維化伴隨著心力衰竭發生發展的全過程。轉化生長因子 β（TGFβ）是重要的促纖維化因子，在病理情況下可通過經典的 TGFβ- Smads 通路誘導心肌纖維化的發生發展，并最終導致心力衰竭。MicroRNAs 是 11～25 個核苷酸長度的單鏈非編碼小 RNAs，可在轉錄后水平調節基因表達，從而導致疾病的發生。TGFβ 通路可在轉錄和轉錄后水平調節纖維化相關 microRNAs 的合成和表達，而 microRNAs 則可在多水平對 TGFβ 通路及其下游基因編碼蛋白進行反應性調節，二者之間存在著精細的自身反饋調節系統，作者將二者之間的復雜相互作用及其反饋調節稱為串話效應（crosstalk）。本文就心力衰竭中心肌纖維化的發病機制做一綜述，重點闡述 TGFβ 信號通路在心肌纖維化中的作用，以及 TGFβ 與microRNAs 的串話效應在心肌纖維化中的自身反饋調節，旨在為心肌纖維化及心力衰竭的防治提供更為特異和有效的作用靶點。

心臟重構；microRNA；轉化生長因子 β；心肌纖維化

心力衰竭是各種危重心血管疾病的終末階段，一旦起始，即使沒有新的心肌損害，臨床亦處于穩定階段，仍可自身不斷發展。心力衰竭已成為發達國家發病率和致死率最高的 疾 病， 心 衰確診 患 者 5 年生 存 率僅為 50%[1]，這為全球帶來了沉重的經濟和社會負擔。因此，各國的研究者一直著眼于尋求有效的心衰防治措施，對心衰的發病機制也有了更加深入的認識：從 20 世紀 40～60 年代的心腎學說到 70～80 年代的血流動力學學說，再到心循環學說以及90年代以來的心臟重構學說，從而為針對其發病機制給予更有效的防治措施提供了理論依據。近年來國內外研究者普遍認為心臟重構是心力衰竭發生發展的根本原因，心臟重構是由包括心肌細胞、心肌成纖維細胞和細胞外基質參與、通過一系列復雜的細胞和分子途徑激活所誘導的動態過程。心臟重構的病理形態主要表現為心肌間質纖維化、心肌細胞肥大和心肌細胞凋亡[2]，其中心肌間質纖維化可以限制心肌細胞活動，增加心肌僵硬度，從而降低心室順應性，影響心肌的收縮和舒張功能，是引起心力衰竭的重要原因。

1 心肌纖維化的物質基礎

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）包括膠原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖及彈力纖維等物質，是生物活性信號分子的儲存庫。ECM 提供了細胞遷移、生長和分化的環境，其中纖維膠原蛋白是 ECM 主要結構蛋白，I 型和 III 型是構成心肌膠原網絡的主要成分（分別為 85%和 10%），I 型膠原具有張力，決定心肌的硬度；III 型膠原的張力較I型膠原弱，但可形成良好的網狀系統，決定心肌的彈性，膠原纖維的數量、分布及排列發生改變均可導致纖維化的發生，是心肌纖維化的物質基礎。心臟成纖維細胞（CFBs）被認為是 ECM 的主要來源[3]，CFBs 在應激下可 轉 分 化 為 心 肌 成 纖 維 細 胞 （MyoFBs）[4]， 具 有 更 大 的 活動性和收縮性，其合成 ECM 的能力也大大增加。MyoFBs是 Gabbiani 于 1971 年 首 先 鑒 定 并 命 名 的[5]， 在 正 常 心 肌中 不 存 在 ， 僅 在 心 臟 受 到 損 傷 之 后 出 現[6]， 許 多 平 滑 肌細 胞標 記可 以 在 MyoFBs 中 表 達而 不能 在 靜 止 CFBs 中表達， 如 α- 平 滑 肌 肌 動 蛋 白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）， 平 滑 肌 肌 球 蛋 白 重 鏈 等[7]。 除 了 產 生 ECM 蛋白，CFBs還可 以 產生 ECM 調 節 蛋白 —— 基 質金 屬 蛋白酶（MMPs）和它們的抑制劑基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs），基質金屬蛋白酶可降解 ECM 成分，而基質金屬蛋白酶組織抑制劑可抑制基質金屬蛋白酶的活性，基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的功能平衡對保持ECM 穩態是至關重要的[8]，在心肌纖維化的發生發展中發揮重要作用。

2 轉化生長因子 β 信號通路及其在心肌纖維化中的作用

2.1 轉化生長因子 β（TGFβ）及經典 TGFβ- Smad 信號通路

TGFβ 是多功能的細胞因子，廣泛參與炎癥、ECM沉積、細胞增殖、分化和生長等多種細胞功能的調節。活化的 TGFβ 通過細胞受體 系 統 介 導發揮作用，TGFβ受體是存在于細胞表面上的跨膜糖蛋白，目前公認的TGFβ 受 體 主 要 有 三 種 （TGFβRI、RII、RIII）[9]。 經 典的 TGFβ 信 號 通 路 通 過 Smads 蛋 白 介 導 發 揮 生 物 學 效應， Smads 介 導 的 TGFβ 信 號 通 路 大 致 是：TGFβ 成 員首先結合并激活細胞表面的 TGFβRII，接著募集并磷酸化 TGFβRI， 活 化 的 TGFβRI與 胞 漿 內 的 R-Smads 結合，使之磷酸化激活，磷酸化的 R-Smads 再與 Co-Smad（Smad4）結合形成復合物，并移位至細胞核，與序列特異的 DNA 結合元件（SBE）結合，并通過募集轉錄激活子或抑制子至轉錄復合物而相應的激活或抑制特定基因的轉錄[10]。 除 了 通 過 Smads 蛋 白 進 行 信 號 轉 導 外，TGFβ 還可以通過其他非經典的信號通路激活，包括 ERK、JNK、p38/MAPK 和小分子 GTP 酶等通路。

2.2 TGFβ 在心肌纖維化中發揮重要作用

TGFβ 在心肌組織中可通過多種途徑發揮強效的促纖維化作用：TGFβ 可通過調節心臟成纖維細胞的表型和功能，促進 MyoFBs 的轉分化，增加 ECM 合成；通過抑制基質金屬蛋白酶活性和誘導基質金屬蛋白酶組織抑制劑合成發 揮 強 效 的 ECM 積 聚 作 用[11]；此 外，TGFβ 可 強 有 力 的誘導結締組織生長因子的表達，與 TGFβ 協同作用可產生 持 久 性 纖 維 化[12]， 在 結 構 性 心 臟病 心 肌 組 織 中 表 達 明顯 上 調。 在人 壓力 負 荷 心 臟中，TGFβ1 明 顯 上調[13]；在壓力負荷大鼠模型中，TGFβ1 中和抗體可拮抗膠原蛋白mRNA 上調、心肌纖維化及舒張功能不全[14]。

3 MicroRNAs 與轉化生長因子 β 在心肌纖維化中的串話效應

3.1 MicroRNAs 的發現、生成及其在心肌纖維化中的作用

MicroRNAs 是 一 類 長 度 為 21～25 個 核 苷 酸 的 非 編碼內源性小單鏈 RNA 分子，在轉錄后水平通過降解靶mRNAs 或抑制靶蛋白翻譯負性調控靶基因的表達。1993年 Lee 等[15]在 秀 麗 隱 桿 線 蟲 中 發 現 第 一 個 microRNA（lin-4），能在轉錄后水平通過抑制核蛋白 lin-14 的表達調 節 線蟲的幼 蟲 發育進程。 在 哺乳動 物 中，microRNAs中 2～8 個核苷酸的“種子序列”與靶 mRNA 的 3’非翻譯區的完全匹配是其負性調控作用的基礎，利用“種子序列”已開發出多種生物信息學軟件，可以在全基因組范圍 內 搜 索 microRNAs 的 靶 基 因， 結 果 顯 示 哺 乳 動 物 大約有 30% 的蛋白編碼基因 受 microRNAs 調節。事實上，靶基 因 預 測 顯 示一個 microRNA 可以抑制多個 蛋 白 編 碼基 因， 而 一 個 基 因 編 碼 蛋 白 可 以 受 多 個 microRNAs 調節。近年來成千上萬的 microRNAs 在動植物中被鑒定出來， 其 中 多 數 在 進 化上 是 高 度 保 守 的[16]。 研 究 者在 研 究小鼠及人類成人器官的 microRNAs 表達譜時發現大約一半 microRNAs 的 表 達 具 有 組 織 特 異 性[17]，microRNAs的表達譜在許多疾病中均發生了戲劇性的改變，提示microRNAs 很可能在人類疾病 的發生發展中發揮重要的調節作用，這在近年來疾病狀態下 microRNAs 表達譜改變的研究中得以印證。

MicroRNAs 的 生 成 始 于 microRNAs 基 因 轉 錄，轉 錄 形 成 初 始 microRNAs（pri-micorRNAs），primicroRNAs 通過兩種 RNaseIII（即 Drosha 酶和 Dicer 酶 ）的 兩 次 剪 切 產 生 成 熟 的 micorRNAs。Drosha 酶 在 細 胞核內將 pri-micorRNAs 剪切形 成包含有 65～80 個核苷 酸的 莖 環 樣 結 構， 即 前 體 microRNAs（pre-microRNAs），pre-microRNAs 迅 速 被 Ras 相 關 核 蛋 白 GTP 酶（Ran-GTP）依賴的核質 /細胞質轉運蛋白 Exportin5 轉運至細胞漿中，然后在胞漿內 Dicer酶的作用下被進一步剪切成 大 約 22 個 核 苷 酸 的 雙 鏈 microRNAs（microRNAs： microRNAs*）， 其 中 成 熟 microRNAs 選 擇 性 地 整 合入 RNA 誘導的沉默復合物（RISC）中與靶 mRNAs 相互作用導致靶 mRNAs抑制或降解，另一條 RNA 鏈（即microRNAs*）隨即被降解。 Drosha 和 Dicer 兩種酶自身并不具有或只有較低的酶活性，只有在其他蛋白的協同作用下才能高效催化其 RNA 底物，例如，Drosha 需要在另外一種稱為 DGCR8的蛋白配合下才能發揮其催化活 性，而 Drosha/DGCR8 復 合 體高效處理 microRNAs 尚需要 RNA 解螺旋酶 p68（DDX5）及 p72（DDX17）的加入。Dicer 酶也需要在因子 TRBP 和 PACT 的協同下識別與 剪 切 pre-microRNAs， 這兩 個 因 子 能 增 強 Dicer 酶 對雙 鏈 RNAs 的 親 和 性 并 參 與 成 熟 microRNAs 鏈 選 擇[18]；Argonaute2(Ago2)是 RISC 的 重 要 組 分， 具 有 很 強 的 類RNaseH 的 活 性， 可 以 通 過 切 割 掉 某 些 pre-microRNAs的 3’臂來幫助 Dicer加工。

MicroRNAs 參與心肌纖維化的調節，多種心血管疾病模型研究顯示 microRNAs 表達譜發生明顯改變，其中至少部分通過調節心肌纖維化進程促進或抑制疾病的進展。新近 文獻詳細論述了 miR-21、29、133、30 和 miR-590 等在 心 肌 纖 維 化 中 的 作用[19]， 闡明 了 microRNAs 的 調 節 機制在心肌纖維化進展中的重要作用。

3.2 MicroRNAs 與 TGFβ 信號通路的 串 話效應在心肌纖維化中的調節

MicroRNAs 以 TGFβ 通路 及其下游基因編碼蛋白為靶點調節心肌纖維化。 前面我們已經介紹了 TGFβ 及其 經 典 TGFβ- Smads 信 號 通 路 在 心肌 纖 維 化 中 的 作用，而近年來研究顯示 TGFβ 通路中的大部分成員是microRNAs 的 靶 標。 運 用 生 物 信 息 學 microRNAs- 靶mRNA 預測可以獲得數個可能的相互作用，但這些計算機預測往往需要實驗驗證，由于缺乏高通量測序的方法進 行 microRNA- 靶 mRNA 相 互 作 用 的 監 測， 至 今 僅 有少 數 microRNAs 與 TGFβ 通 路 成 員 的 相 互 作 用 得 以 驗證 ，已有綜述對此進 行 了 總結[20]。 在 心 臟纖維化過程中，miR-133 通過調節狗心房成纖維細胞中靶蛋白 TGFβ1的 水 平， 有 效 抑 制 心肌 纖 維 化 的 發 展[21]。 Liang 等[22]研究 證實 TGFβRIII 作為 TGFβ 信 號通 路 的負性 調 控子，可抑制其心肌纖維化作用，而 miR-21 可直接負性調節TGFβRIII 的表達，對心肌纖維化起到促進作用。此外，microRNAs 還可以調節 TGFβ 通路靶基因編碼蛋白，結締組織生長因子（CTGF）作為 TGFβ 信號通路的靶分子，是一種強效致纖維化因子，作為 miR-1 和 miR-133 的靶蛋 白 被 直接 負 性 調 控[23]。 可見 ， microRNAs 可 在 多 水 平通過與 TGFβ 通路蛋白相互作用調節心肌纖維化的發生發展過程。

TGFβ- Smads 通 路 可 在 轉 錄 和 轉 錄 后 水 平 調 節microRNAs 的合成和表達。首先，microRNAs 自身的表達水平可通過 Smads 蛋白在轉錄和轉錄后水平調節。Smads蛋白對 microRNAs 在轉錄水平的調節主要是通過 TGFβ-Smads 經 典 信 號 通 路，R-Smad/Co-Smad 復 合 體 通 過 與核 內 Smads 結 合 元 件 (SBE) 相 互 作 用 正 性 或 負 性 調 節microRNAs 基 因 的 轉 錄， 轉 錄 生 成 的 pri-microRNAs 經歷正常的 microRNA 加工處理過程。其次，Smads 蛋白對microRNAs 在轉 錄 后水 平的 調 節則 是通 過 對 microRNAs加工成熟過程的調節 完 成的。研究證實 R-Smads 可以通過 與 p68/p72 相互作用以增強 Drosha 調 節 的特定 primicroRNAs 的 剪 切 活 性， 例 如 miR-21[24]。 為 了 研 究 可被 Smads 調 節 的 pri-microRNAs 的 結 構 特 性， 進 行 了microRNAs 芯片表達譜的研究，結果表明大約 5% 被檢測microRNAs 可以同時被 TGFβ 和骨形態發生蛋白（BMP）誘導，而這些 microRNAs 的成熟形式的 3’序列末端均包含一個 SBE 樣的序列（R-SBE）[25]，R-SBE 是 Smads 蛋白與 pri-microRNAs 結合所必要的。此外，Smads 蛋白還可能通過介導表觀遺傳學的調節方式來實現 microRNAs 的表達改變。

4 結語

心肌纖維化是心臟重構的重要組成部分，是眾多心血管疾病的病理表現及致病因素，貫穿于心力衰竭發生發展的整個過程。心肌纖維化的物質基礎是 ECM 的過度沉積及錯誤排列，TGFβ 是強效致纖維化因子之一，其相關信號通路可通過促進 ECM 沉積、降解基質金屬蛋白酶以及抑制基質金屬蛋白酶組織抑制劑等途徑促進心肌纖維化的發生。此外，TGFβ- Smads 通路蛋白還可以通過在轉錄和轉錄后水平調節特定 microRNAs 的合成及成熟對心肌纖維化進行轉錄后水平的調節，而此通路蛋白同樣受microRNAs 在多水平的調節，這一發現使我們對心肌纖維化的調節機制有了更深入的認識，TGFβ- Smads 信號通路與 microRNAs 之間的串話效應在心肌纖維中形成了一個自身反饋調節系統，使各種不同病因下的心肌纖維化受到精細的調節。以 TGFβ 及 microRNAs 之間的反饋環路為靶點治療心肌纖維化，有望為心肌纖維化和心力衰竭的治療掀開新的一頁。

[1]Roger VL, Weston SA, Redfield MM, et al. Trends in heart failure incidence and survival in a community-based population . JAMA , 2004, 292: 344-350.

[2]Fedak PW, Verma S, Weisel RD, et al. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man . Cardiovase Pathol, 2005, 14: 1-11.

[3]Krenning G, Zeisberg EM, Kalluri R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis . J Cell Physiol , 2010, 225: 631-637.

[4]Petrov VV, Fagard RH, Lijnen PJ. Stimulation of collagen production by transforming growth factor-beta1 during differentiation of cardiac fibroblasts to myofibroblasts . Hypertension, 2002, 39: 258-263.

[5]Gabbiani G, Ryan GB, Majne G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction . Experientia, 1971, 27: 549-550.

[6]Baum J, Duffy HS. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about ? J Cardiovasc Pharmacol, 2011, 57: 376-379.

[7]Santiago JJ, Dangerfield AL, Rattan SG, et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts . Dev Dyn, 2010, 239: 1573-1584.

[8]Moore L, Fan D, Basu R, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) in heart failure. Hear t Fail Rev, 2012, 17: 693-706.

[9]Schiller M, Javelaud D, Mauviel A. TGF-beta-induced SMAD signaling and gene regulation: consequences for extracellular matrix remodeling and wound healing . J Dermatol Sci, 2004, 35: 83-92.

[10]Feng XH, Derynck R. Specificity and versatility in TGF- Signaling through smads . Annu Rev Cell Dev Biol, 2005, 21: 659-693.

[11]Frantz S, Hu K, Adamek A, et al. Transforming growth factor beta inhibition increases mortality and left ventricular dilatation after myocardial infarction . Basic Res Cardiol, 2008, 103: 485-92.

[12]Dobaczewski M, Bujak M, Li N, et al. Smad3 signaling critically regulates fibroblast phenotype and function in healing myocardial infarction . Circ Res, 2010, 107: 418-28.

[13]Villar AV, Llano M, Cobo M, et al . Gender differences of echocardiographic and gene expression patterns in human pressure overload left ventricular hypertrophy . J Mol Cell Cardiol , 2009, 46: 526-535.

[14]Kuwahara F, Kai H, Tokuda K, et al . Transforming growth factorbeta function blocking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure-overloaded rats . Circulation , 2002, 106: 130-135.

[15]Lee RC, Feinbaum RL, Amobros V. et al. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 . Cell, 1993, 75: 843-854.

[16]Altuvia Y, Landgraf P, Lithwick G, et al. Clustering and conservation patterns of human microRNAs . Nucleic Acids Research, 2005, 33: 2697-2706.

[17]Lee EJ, Baek M, Gusev Y, et al. Systematic evaluation of microRNA processing patterns in tissue, cell lines, and tumor. RNA, 2008, 14: 35-42.

[18]Zeng Y. Principles of microRNA production and maturation . Oncogene, 2006, 25: 6156-6162.

[19]Bauersachs J. Regulation of myocardial fibrosis by microRNAs . J Cardiovas Pharmacol, 2010, 56: 454-459.

[20]Henriett B, Karoly R, Laszlo H, et al. Crosstalk between TGF-βsignaling and the microRNA machinery. Cell, 2012, 33: 382-390.

[21]Shan H, Zhang Y, Lu YJ, et al. Downregulation of miR-133 and miR-590 contributes to nicotine-induced atrial remodelling in canines . Cardiovasc Res, 2009, 83: 465-472.

[22]Liang HH, Zhang C, Ban T, et al. A novel reciprocal loop between microRNA-21 and TGFβRIII is involved in cardiac fibrosis . Int J biochem cell , 2012, 44: 2152-2160.

[23]Rudy FD, Anke J, Tijsen BS, et al. miR-133 and miR-30 regulate connective tissue growth factor: implications for a role of microRNAs in myocardial matrix remodeling . Circulation, 2009, 104: 170-178.

[24]Davis BN, Hilyard AC, Lagna G, et al. SMAD proteins control DROSHA- mediated microRNA maturation . Nature, 2008, 454: 56-61.

[25]Davis BN, Hilyard AC, Nguyen PH, et al. Smad proteins bind a conserved RNA sequence to promote microRNA maturation by drosha. Mol Cell, 2010, 39: 373-384.

2013-05-28)

（編輯：常文靜）

130033 吉林省長春市，吉林大學中日聯誼醫院 心血管內科

楊四寶 博士研究生 主要從事心血管疾病及相關基礎研究 Email：yangsb911@163.com 通訊作者：楊萍 Email：pyang@jlu.edu.cn

R54

A

1000-3614（2013）07-0552-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.07.21