鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖質量比較的研究進展

韋麗文辛 寧李培泰時顯蕓*

（1 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2 廣西生態工程職業技術學院，廣西 柳州 545004）

鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖質量比較的研究進展

韋麗文1辛 寧1李培泰2時顯蕓1*

（1 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2 廣西生態工程職業技術學院，廣西 柳州 545004）

鐵皮石斛是一種名貴中藥材，其藥理作用廣泛，得到了廣泛應用，但其自然繁殖率低，資源形勢較為嚴峻。近年來，研究者們多集中于對鐵皮石斛的胚性組織原球莖進行研究，本文通過對比研究鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖在化學成分、藥理作用、石斛多糖成分的提取及測定方法上的差別，以探討鐵皮石斛原球莖成為鐵皮石斛新藥材資源的可能性。

鐵皮石斛；鐵皮石斛原球莖；質量比較

鐵皮石斛藥材為蘭科屬植物鐵皮石斛的干燥莖，具有益胃生津，滋陰清熱等功效，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨萎軟等病癥。因其種子極小、無胚乳、自然繁殖率極低[1]，被列為國家二級保護植物，而人們不斷地開發使用，使得鐵皮石斛資源迅速減少，因此，如何持續利用鐵皮石斛藥材，或開發鐵皮石斛的藥材新資源，成為近年來眾多研究者們的新課題。鐵皮石斛原球莖是由鐵皮石斛種子通過無菌培養誘導繁殖形成的[2]。它是種子萌發過程中，原胚萌動膨大，突破種皮后形成的淺黃色小圓錐形胚性組織[3]。以鐵皮石斛原球莖為材料進行組織培養，通過改變培養基條件，可使鐵皮石斛原球莖生長旺盛，繁殖率高，具有較好的開發前景[4]。本文對鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖化學成分、藥理作用、石斛多糖提取及測定方法進行對比研究，探討鐵皮石斛原球莖作為鐵皮石斛新藥源的可能性。

1 化學成分

1.1 鐵皮石斛的化學組成

鐵皮石斛的化學組成主要有石斛多糖、生物堿、氨基酸、菲類化合物以及金屬元素等。石斛多糖為鐵皮石斛的最主要成分，是其發揮藥理作用的重要物質基礎。吳剛等[5]通過對19種石斛的多糖及生物堿含量進行測定發現，鐵皮石斛的多糖含量為19.26%，總生物堿含量為0.359%。蔣秀梅等[6]檢測出鐵皮石斛鮮品含有6種人體必需氨基酸，1種半必需氨基酸，其中谷氨酸和天門冬氨酸的含量最高。黎萬奎等[7]通過實驗比較了人工栽培鐵皮石斛與其他來源鐵皮石斛中氨基酸含量得出人工栽培鐵皮石斛與其他不同來源鐵皮石斛材料中各種氨基酸組成及含量一致，以天冬氨酸含量最高，其次為谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸等。李榕生等[8]運用各種柱色譜方法進行化學成分分離提純，從而得到六種化合物，分別鑒定為2，3，4，7-四甲氧基菲、1，5-二羧基-1，2，3，4-四甲氧基菲、2，5-二羥基-3，4-二甲氧基菲、2，7-二羧基-3，4，8-三甲氧基菲、2，5-二羧基-3，4-二甲氧基菲、3，5-二羧基-2，4-二甲氧基菲。其中化合物1，5-二羧基-1，2，3，4-四甲氧基菲、2，5-二羥基-3，4-二甲氧基菲、3，5-二羧基-2，4-二甲氧基菲為首次從石斛屬植物中分離得到。諸燕等[9]采用電感耦合等離子質譜法、原子吸收光譜法對11個種質32個樣品的鐵皮石斛的金屬元素進行檢測，結果發現鐵皮石斛中鉀、鈣、鎂、錳、鋅、鉻、銅平均質量分數分別為1205.23，766.82，158.25，31.06，4.28，8.28，0.97mg/kg，砷、汞、鉛、鎘4種重金屬元素含量除1個樣品鎘元素超過限量指標0·07mg/kg外，均在規定限度范圍內，種質與生理年齡對金屬元素的積累影響顯著。

1.2 鐵皮石斛原球莖的化學成分

鐵皮石斛原球莖是由鐵皮石斛組織分化形成，具有與鐵皮石斛藥材相似的化學組成，但在各成分的含量以及單一成分的組成上仍有一定差別，而鐵皮石斛原球莖可通過改變不同培養條件使其中有效成分含量得以提高。在這一問題上陳曉梅等人進行了較為深入的研究，其運用高效液相-質譜分析法對真菌誘導子處理的鐵皮石斛原球莖和對照原球莖以及鐵皮石斛的指紋圖譜進行研究分析得出經誘導子處理的鐵皮石斛原球莖沒有改變原球莖的化學背景，和鐵皮石斛的化學成分相似，而真菌誘導子能促進原球莖中生物堿類成分的產生和特異性積累，石斛多糖是鐵皮石斛及其原球莖的共有成分，但在單糖的組成上有所差異[10]。在培養原球莖過程中加入MF24液體發酵菌絲制備的誘導子可提高原球莖的多糖含量[2]。其用相同的提取方法對鐵皮石斛藥材及其原球莖的多糖成分進行提取，石斛粗多糖主要由Man和Glu組成，而原球莖粗多糖主要由Gal、Ara 和Glu組成[11]。何鐵光等[12]通過實驗分析得出鐵皮石斛野生品及其懸浮培養的原球莖都含有17種氨基酸，前者以谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸和亮氨酸為主要氨基酸，后者以懸浮培養的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸為主要氨基酸，在人體必需氨基酸中，兩者都含有除色氨酸以外的全部人體必需氨基酸，其中，亮氨酸比例最高。孟志霞等[3]從鐵皮石斛原球莖中得到8個化合物，分別1-O-p-阿魏酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅰ），arillatoseB（Ⅱ），4-（β-D-吡喃葡萄糖基）芐醇（Ⅲ），4-羥甲基-2，6-二甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅳ），三十六烷酸（Ⅴ），二十七烷醇（Ⅵ），β-谷甾醇（Ⅶ），3β，25-二羥基-23-烯-環菠蘿蜜烷（Ⅷ），其中化合物1、2、3、4、8為首次從石斛屬中分得。

2 藥理作用

2.1 鐵皮石斛的藥理作用

鐵皮石斛中含有的多糖、生物堿、氨基酸等化學成分是其藥理作用發揮的重要物質基礎，鐵皮石斛具有提高人體免疫力、抗氧化以及抗腫瘤等方面的作用，隨著研究的不斷深入，一些新的藥理作用也逐漸被發現。趙水靈等[13]對石斛多糖進行研究發現其能使小鼠的胸腺、脾等部位的重量增加、抗體細胞數明顯增多，從而使免疫作用得以增強。鮑素華等[14]通過對鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究，發現鐵皮石斛多糖隨著濃度的增大其抗氧化的活性也逐漸增強。鮑麗娟[15]對四種石斛的抑瘤作用進行了研究，其中鐵皮石斛提取物中的乙酸乙酯部位對人宮頸癌HelaS3的抑制作用相對于石油醚部位、正丁醇部位以及水提物的效果要好，而石油醚部位對于肝癌HepG2的抑制較好，但四個部位的抑瘤作用差別不大。

2.2 鐵皮石斛原球莖的藥理作用

相似的化學組成，致使鐵皮石斛原球莖與鐵皮石斛有著相似的藥理作用。何鐵光等[16]鐵皮石斛原球莖進行研究表明其多糖含量與野生鐵皮石斛的相當，且能通過提高機體免疫功能和抗氧化能力抑制腫瘤的生長。高建平等[17]比較了鐵皮石斛原球莖與原藥材的免疫調節作用發現，原球莖能提高機體非特異性免疫功能和細胞免疫功能，并與原藥材相比作用強度相似。何鐵光等[18]對鐵皮石斛原球莖中多糖DCPP1a-1抗腫瘤活性進行研究，發現三個不同劑量的多糖DCPP1a-1對小鼠肝癌H22有不同的抑制效果，其中低劑量組（50mg/k）相對于中劑量組（150mg/kg）及高劑量組（250mg/kg）的抑制作用更為顯著，與腫瘤對照相比，多糖低劑量組小鼠的胸腺和脾指數顯著增加了，增強了小鼠的機體免疫力。此研究組還對鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1對氧自由基和脂質過氧化的影響進行了研究，實驗結果表明鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1具有較強的抗氧化活性。林宏等[19]利用細胞溶血法測定鐵皮石斛原球莖中均一多糖D-02C的CH50值，并與肝素鈉的CH50值進行對比研究對比表明D-02C具有較弱的補體活性。

3 石斛多糖的提取及含量測定

3.1 鐵皮石斛及鐵皮石斛原球莖中多糖成分的提取

石斛多糖是鐵皮石斛發揮其藥效的重要物質基礎，也是其含量較多的一類成分，那么如何高效提取石斛多糖，成為眾多學者的課題，鐵皮石斛藥材中多糖成分的提取方法經歷了由傳統的水提醇沉法到超聲提取、酶提取的發展，使得石斛多糖的提取效率得到大大地提高。錢葉等[20]對粉碎度、提取次數、加水量及提取時間等因素對石斛多糖提取的影響大小進行了正交試驗，結果表明影響石斛提取含量的因素依次為粉碎度＞提取次數＞加水量＞提取時間。在水提法的基礎上加入超聲提取法，可以使石斛多糖的提取率得到提高，即在將石斛粉過篩后對其進行超聲水浴提取，通過對比得出當超聲功率為300W時，超聲頻率為45kHz時多糖得率最高[21]。魏明等[22]發現，當超聲波功率達到300W時多糖提取量為最大值。當超聲波功率過大時，可能因為超聲波的劇烈振動使多糖降解，從而使得多糖提取量出現了下降的趨勢[23]。尚喜雨[24]對鐵皮石斛多糖用水提法、酶法進行了研究，其中水提法的最佳提取條件為：固液比1∶80，水溫100℃，浸提時間2h，提取次數2次；聯合酶法的最佳提取條件為：酶量（木瓜蛋白酶和纖維素蛋白酶等量混合）4%，水溫為40℃，pH值為6，酶解3h。結果水提法的多糖平均提取率為12.07%，酶法的多糖平均提取率為20.84%，說明聯合酶法提取鐵皮石斛多糖優于單純水提法。

鐵皮石斛藥材中石斛多糖的提取方法已經研究得較為透徹，從目前的研究狀況觀察可知，用于鐵皮石斛原球莖多糖的提取方法為水提法，其提取過程與鐵皮石斛藥材中多糖的水提法過程相似，也有研究者對此方法的影響因素進行了比較優選。何鐵光[18]選用熱水浸提，并對浸提時間、浸提次數、溫度及加水量等4個因素進行正交試驗，實驗結果表明各因素作用大小關系依次為提取次數＞加水量＞提取溫度＞浸提時間，且最佳條件為提取2h，提取次數為3次，溫度為80℃，加水量20倍，劉靜平等[25]運用正交試驗優選鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝相似結論。岑忠等[26]對用熱水浸提鐵皮石斛原球莖多糖的條件進行了優選，實驗結果表明影響最大的因素是浸提次數，其次是浸提時間，料水質量比和浸提溫度。且最佳實驗條件為浸提次數為4次，浸提3h，料水質量比為1∶60，近體溫度為80℃，多糖得率達到9.17%。

4 鐵皮石斛藥材及其原球莖石斛多糖的含量測定

多糖成分對鐵皮石斛的重要性決定了對其進行含量測定并作為鐵皮石斛的質量評價標準有著重要的意義，石斛多糖含量測定的方法主要有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、DNS（3，5-二硝基水楊酸比色法），有觀點認為DNS較優于前兩種方法。林雅等[27]采用蒽酮-硫酸法測定石斛中的多糖含量，其依據多糖在硫酸的作用下先水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后利用與蒽酮的顯色反應生成橙黃色化合物，最后以比色法測定其吸光值，進而計算出多糖含量。劉宏源等[28]首次采用DNS（3，5-二硝基水楊酸比色法）法測定鐵皮石斛中水溶性多糖的含量，并認為該方法具有重復性好、雜質干擾少、快速、準確靈敏等優點。因DNS在偏堿性條件下與多糖水解產物還原糖共熱后被還原生成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸）。該化合物在一定的濃度范圍內，還原糖的量和反應液的顏色呈比例關系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。林燕飛等[29]利用3，5-二硝基水楊酸比色法，以葡萄糖為對照測定，研究鐵皮石斛不同采收期和不同生長期水溶性多糖的含量變化規律，研究者認為DNS（3，5-二硝基水楊酸）相比較苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法具有明顯的優點，因鐵皮石斛中的主要藥效成分是水溶性多糖而非單糖，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法二個方法僅能測定總水溶性糖，而DNS法可以通過測定還原糖（或單糖）和總糖，從而計算得到總水溶性多糖。目前，原球莖多糖含量的測定方法則多采用苯酚-硫酸法[30-31]。

5 結 語

通過對鐵皮石斛及其原球莖進行質量對比研究發現，兩者的化學組成、藥理作用都較為相似，均具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤活性，兩者發揮藥理作用的重要物質基礎均為石斛多糖，但在多糖的含量以及組成上兩者有著一定的差別，鐵皮石斛胚性組織原球莖有作為鐵皮石斛新藥材資源的可能性，因此，鐵皮石斛原球莖多糖成分在其生長過程中有著怎樣的變化積累過程，以及怎樣通過改變培養條件來增加其多糖成分，值得深入研究。其次，鐵皮石斛和鐵皮石斛原球莖在多糖的提取及測定方法上較為相似，但相對于鐵皮石斛多糖較為豐富的提取及測定方法而言，運用于提取及測定鐵皮石斛原球莖中石斛多糖的方法卻十分單一，那么，原球莖多糖在提取及含量測定方法上能否運用原藥材的優選條件仍有探討價值。

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R282.71

A

1671-8194（2013）25-0059-03

廣西鐵皮石斛品種資源評價及優良品種繁育技術研究（2013CD）

*通訊作者：E-mail:shxy655@126.com