人羊膜的研究進(jìn)展

馬曉峰董樂樂

(1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙 包頭 014010)

人羊膜的研究進(jìn)展

馬曉峰1董樂樂2

(1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙 包頭 014010)

通過大量查閱國內(nèi)外有關(guān)人羊膜的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究文獻(xiàn)并總結(jié)這些研究成果。可以人了解羊膜的來源廣，價(jià)格低、與細(xì)胞相容性好、抗原性低，羊膜上皮層具有上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞生長因子等多種細(xì)胞生長因子，而基底膜含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ等多種類型膠原、纖維橋接蛋白及多種糖蛋白，由于這些結(jié)構(gòu)的特殊性，使其能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的生長。近年來隨著組織工程生物工程對(duì)羊膜的進(jìn)一步研究，人羊膜在臨床中的應(yīng)用會(huì)更加被重視。

人羊膜；基礎(chǔ)；組織工程；臨床應(yīng)用

人羊膜作為一種生物材料，在基礎(chǔ)研究及臨床中的應(yīng)用已有很多年的歷史。1910年，Davis用胎膜作為手術(shù)替代材料進(jìn)行皮膚移植，并取得成功。1913年，Stem和Sabella分別報(bào)導(dǎo)了用羊膜來治療皮膚燒傷和皮膚潰瘍[1-3]。隨后羊膜被應(yīng)用于各種手術(shù)，包括：眼科、顱腦外科、腹腔外科和婦科等。隨著對(duì)人羊膜的的進(jìn)一步研究，隨著組織工程及生物工程的發(fā)展，人羊膜在臨床中的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

1 概 述

1.1 羊膜的結(jié)構(gòu)和功能

羊膜位于胎兒絨毛膜的表面，從細(xì)胞滋養(yǎng)層衍生而來，是光滑、無神經(jīng)、無血管、無淋巴的雙層透明膜，厚0.02～0.05mm，是人體最厚的基底膜[4-6]。羊膜由5層機(jī)構(gòu)構(gòu)成：羊膜上皮，基底膜，致密層，成纖維細(xì)胞層，海綿層[7，8]。每層結(jié)構(gòu)都有其獨(dú)特的作用，并且含有多種生長因子，這些生長因子主要由羊膜上皮細(xì)胞分泌[9]。主要包括：生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、肝細(xì)胞生長因子、角化細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子1、2[10]。組織學(xué)及電鏡觀察證實(shí)，胚胎早期的羊膜具有和胎兒皮膚相似的組織結(jié)構(gòu)，從而認(rèn)為羊膜具有和皮膚相同的屏障和防御保護(hù)功能。運(yùn)用于創(chuàng)面的修復(fù)能起到保護(hù)創(chuàng)面不受到細(xì)菌等微生物侵入，減少感染的作用。一般情況下，β3-防御素是細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖或脂多糖對(duì)羊膜上皮形成刺激而產(chǎn)生的。防御素是一類內(nèi)源性抗菌肽，它具有很廣泛的抗微生物活性，對(duì)革蘭陽性、陰性細(xì)菌、真菌及薄膜病毒的殺傷作用很強(qiáng)。所以認(rèn)為羊膜具有天然免疫性[11]。羊膜的上皮細(xì)胞還具有潛在的分化能力，因?yàn)橐呀?jīng)有研究證實(shí)鼠羊膜上皮在特定生化條件下不僅分化為毛囊上皮細(xì)胞，而且還可以分化為皮膚[12]。此外，羊膜基底膜中存在大量富含硫酸乙酰肝素的蛋白多糖，可以起到與皮膚相似的屏障作用，使羊膜成為半通透膜。

1.2 常用羊膜的特點(diǎn)以及類型

在對(duì)羊膜進(jìn)行臨床研究以及基礎(chǔ)研究的過程中，羊膜細(xì)胞外基質(zhì)、凍存羊膜以及新鮮羊膜是最常用的羊膜材料，它們的特點(diǎn)各不相同，且制備方法有所不同。凍存羊膜和羊膜外基質(zhì)首先需要制備新鮮羊膜。新鮮羊膜在制備過程中保留了羊膜上皮細(xì)胞及各種細(xì)胞因子，有利于眼表的重建，故用來治療眼表疾病。然而因?yàn)樾迈r羊膜含有細(xì)胞成分，所以有輕微抗原性，且保存時(shí)間不長，使用起來不太方便。與新鮮羊膜比較，凍存羊膜能夠保存較久，使用起來要方便很多。所謂的羊膜外基質(zhì)主要是指除去可溶性蛋白以及細(xì)胞，僅保留原組織中不能被溶解的成分，此類不可溶解的成分主要有結(jié)構(gòu)蛋白、氨基葡聚糖、彈性蛋白、膠原蛋白等，將此類物質(zhì)作為細(xì)胞的生長支架，不僅有利于細(xì)胞的黏附，而且保存時(shí)間長，方便使用[5]。

1.3 羊膜的制備

按照供體醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，必須嚴(yán)格檢查捐贈(zèng)者的身體狀況，通過血清學(xué)檢測(cè)保證其未受乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒，巨細(xì)胞病毒和梅毒螺旋體的感染，捐贈(zèng)者無產(chǎn)道感染淋球菌或衣原體病史，無其他傳染性疾病和惡性腫瘤。

1.3.1 新鮮羊膜的制備：新鮮羊膜的制備有多種方法。在這里介紹一種常用方法：將羊膜取下，清洗，去血污，然后置入0.5%胰酶中消化（一塊羊膜約300mL），37℃，30min～1h，中間稍加攪拌，消化以羊膜的蛻膜層能脫落為準(zhǔn)。消化后的羊膜直接放入1mol/L碳酸氫鈉中浸泡（200mL），4℃，20h，時(shí)間過長會(huì)影響質(zhì)量，此時(shí)的羊膜應(yīng)該是潔白而且是半透明，雙蒸水反復(fù)沖洗至pH至7～8左右，置入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，每天液體要更換一次，1周左右就可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 制備凍存羊膜[4]：將制備好的羊膜放入4℃的純甘油中進(jìn)行脫水處理，每隔24h對(duì)甘油液體進(jìn)行1次更換，液體的更換次數(shù)總共為3次。完成上述工序后，將其放入4℃恒溫冰箱中保存?zhèn)溆谩⒔?jīng)過脫水處理的羊膜取出，放入到含有硫酸軟骨素的DMEM液與純甘油的混合液（其比例為1∶1）中浸泡，-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，6個(gè)月備用。

1.3.3 羊膜細(xì)胞外基質(zhì)的制備：將經(jīng)甘油脫水后的羊膜取出，PBS液水化，加入0.25%胰蛋白酶，37℃室溫下消化，再用細(xì)胞刮子刮除殘存的羊膜上皮細(xì)胞，于倒置相差顯微鏡下，證實(shí)無細(xì)胞后羊膜上皮面朝上平鋪于乙酸纖維薄膜紙上，加入含硫酸軟骨素的100%甘油∶DMEM液(1∶1)中浸泡，置于4℃恒溫冰箱儲(chǔ)存，1周備用，或-80℃超低溫儲(chǔ)存，6個(gè)月備用。有研究者將生理鹽水漂洗后的羊膜用0.2%戊二醛交聯(lián)，0.5%十二烷基磺酸鈉、0.25%胰酶脫細(xì)胞，反復(fù)漂洗，冷凍干燥，分裝密封，環(huán)氧乙烷消毒備用。

2 臨床應(yīng)用

2.1 眼科：羊膜的臨床應(yīng)用比較廣泛，目前眼科應(yīng)用較多。眼科主要用羊膜行結(jié)膜疾病導(dǎo)致的結(jié)膜缺損、角膜疾病致角膜缺損的移植。Gris等[9]報(bào)道了用凍干羊膜治療眼科疾病的長期隨訪研究，其結(jié)果表明，在對(duì)眼表疾病進(jìn)行治療的過程中，羊膜具有較高的安全性，特別是對(duì)于結(jié)膜切除術(shù)后結(jié)膜缺損的患者，尤為實(shí)用。

2.2 燒傷整形科：近年羊膜廣泛的運(yùn)用于燒傷患者的皮膚缺損的覆蓋與修復(fù)。廣西省梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院燒傷整形外科陳燕圖、黃仁勝等[6]對(duì)102例燒傷患者應(yīng)用羊膜敷料覆蓋213個(gè)創(chuàng)面的臨床治療后，療效確切滿意。主要表現(xiàn)為疼痛減輕，創(chuàng)面滲出減少，全身性反應(yīng)輕，創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短。羊膜覆蓋后，膜下很少積液，減少了創(chuàng)面感染的因素。

2.3 除了在眼科于燒傷整形科得應(yīng)用外，近年不少學(xué)者在骨外科嘗試運(yùn)用羊膜治療疾病。如肌腱斷裂、神經(jīng)損傷，而且在這些方面也做了很多基礎(chǔ)研究。羅靜聰?shù)萚8]在實(shí)驗(yàn)中將肌腱切斷，重新縫合后用人脫細(xì)胞羊膜包裹，與對(duì)側(cè)不用羊膜的肌腱比較，雖然未發(fā)現(xiàn)羊膜對(duì)肌腱愈合有影響，但證實(shí)羊膜能有效減少肌腱粘連。MLigiliche等[7]將脫細(xì)胞羊膜制成管狀誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生.隨著對(duì)羊膜研究的進(jìn)一步深入，我們相信羊膜的應(yīng)用會(huì)更加廣泛的應(yīng)用于臨床，為更多患者帶來福音。

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