昆明石杉中非生物堿類成分研究

李齊激， 鄒 娟， 李繼新， 張敬杰， 劉亞華， 潘爐臺*

(1.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002;2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

昆明石杉Huperzia kunmingensisChing為石杉科石杉屬蕨類植物，我國特有種，分布于我國云南、貴州、廣西。味苦、辛，性微溫，具有益智醒神，化瘀止血的功效，主要用于治療健忘，神志不清，跌打損傷等［1-3］。對該屬植物的研究已取得許多翔實的研究資料，主要集中在物質基礎、質量分析、藥理藥效及臨床應用方面［4-8］。前期測定該植物中石杉堿甲的量 (為0.03%)［9］時，發現該植物除含生物堿外，非生物堿類成分也十分豐富，且迄今未見該植物的化學成分研究報道。本實驗主要對該植物中非生物堿類成分進行研究。

1 儀器和材料

Varian INOVA—400型核磁共振波譜儀 (美國Varian有限公司);XRC—1顯微熔點測定儀 (溫度未校正，四川大學科儀廠);WFH—203B型三用紫外分析儀 (上海精特實業有限公司);Buchi R—215型旋轉蒸發儀 (瑞士 Buchi有限公司);Metter-Toledo電子天秤 (瑞士 Metter-Toledo公司);Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia＆Upjohn公司);制備薄層 (GF254)及柱層析用硅膠 (200～300目)均購自青島海洋化工有限公司;NMR測試溶劑為氘代試劑;其余試劑均由工業純經重蒸處理使用。

實驗材料于2008年12月采自貴州省雷山縣，經貴州省科學院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉HuperziakunmingensisChing，憑證標本(GM200803)存放于貴陽中醫學院中藥研究所。

2 提取分離

取自然干燥的昆明石杉全草粉末0.6 kg，用95%的甲醇水浴回流提取3次 (3 h/次)，合并濾液并減壓濃縮得浸膏207.0 g。經硅膠柱層析梯度洗脫 (石油醚-乙酸乙酯，20∶1→0∶1)得流份Fr.1～Fr.9。

Fr.3(9∶1)經硅膠柱層析石油醚-乙酸乙酯(30∶1→5∶1)梯度洗脫，10∶1部分用TLC分析合并后過夜析出針狀晶體7(150.8 mg)，母液濃縮后經硅膠柱層析石油醚-丙酮 (30∶1→10∶1)梯度洗脫，15∶1部分經TLC分析合并后用丙酮、甲醇分別重結晶得化合物5(18.2 mg)、6(11.1 mg);Fr.5(8∶2)經硅膠柱層析石油醚-乙酸乙酯 (15∶1→3∶1)梯度洗脫，8∶1部分經Sephadex LH-20得化合物3(14.7 mg)，Fr.7(7∶3)經制備薄層 (石油醚-丙酮，3∶1)得化合物4(103.2 mg)，Fr.8(5∶2)經硅膠柱層析石油醚-丙酮 (10∶1→1∶1)梯度洗脫，5∶1部分經TLC分析合并后用制備薄層 (石油醚-丙酮3∶1)得化合物1(98.2 mg)、2(10.1 mg)，3∶1部分合并得8(319.1 mg)。

3 結構鑒定

化合物1:無色方晶 (甲醇)，mp 235～236℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR(C5D5N，400 MHz)δ:5.93(1H，br s，H-15)，4.44(1H，br s，H-3β)，3.58(1H，br s，H-21α)，4.08(1H，br d，J=9.7 Hz，H-24)，3.85(1H，br d，J=10.4 Hz，H-24);13C-NMR(C5D5N，100 MHz)δ:34.1(C-1)，26.9(C-2)，69.9(C-3)，44.2(C-4)，50.2(C-5)，19.8(C-6)，45.8(C-7)，38.3(C-8)，62.7(C-9)，38.6(C-10)，25.9(C-11)，26.7(C-12)，59.1(C-13)，163.7(C-14)，128.9(C-15)，201.4(C-16)，59.5(C-17)，44.7(C-18)，32.0(C-19)，25.3(C-20)，75.9(C-21)，37.6(C-22)，23.7(C-23)，65.8(C-24)，16.6(C-25)，20.0(C-26)，55.6(C-27)，15.2(C-28)，22.2(C-29)，29.1(C-30)。與文獻［10］對比，數據基本一致，故鑒定化合物1為3α，21β，24-trihydroxyserrat-14-en-16-one。

化合物2:白色針晶 (甲醇)，mp 312～313℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR(C5D5N，400 MHz)δ:5.48(1H，br s，H-15)，3.45(1H，br d，J=7.1 Hz H-3β)，4.19(1H，dd，J=9.6，2.4 Hz，H-29)，3.96(1H，dd，J=9.6，4.1 Hz，H-29)，4.60(1H，br s，H-21α);13C-NMR(C5D5N，100 MHz)δ:39.1(C-1)，28.5(C-2)，77.9(C-3)，39.6(C-4)，56.1(C-5)，19.4(C-6)，45.6(C-7)，37.4(C-8)，63(C-9)，38.5(C-10)，25.7(C-11)，27.6(C-12)，57.6(C-13)，139.0(C-14)，122.9(C-15)，24.5(C-16)，44.8(C-17)，36.4(C-18)，31.9(C-19)，26.6(C-20)，69.7(C-21)，43.5(C-22)，28.8(C-23)，16.1(C-24)，16.4(C-25)，20.1(C-26)，56.6(C-27)，14.7(C-28)，65.0(C-29)，23.1(C-30)。與文獻［11］對比，數據基本一致，故鑒定化合物2為 serrat-14-en-3β，21β，29-triol。

化合物3:白色針晶 (三氯甲烷)，mp 297～298℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。1H-NMR、13CNMR及DEPT譜揭示該化合物含30個碳原子，1H-NMR δ 5.34(1H，br s)提示含環內雙鍵，3.18(1H，dd，J=11.2，4.5 Hz)，3.23(1H，dd，J=11.1，4.7 Hz)暗示該化合物連結有2個羥基，其偶合常數揭示 H-3、H-21分別為 α、β 構型［12］;13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:38.4(C-1)，25.1(C-2)，78.8(C-3)，38.0(C-4)，55.6(C-5)，18.7(C-6)，45.0(C-7)，38.7(C-8)，57.0(C-9)，36.1(C-10)，25.1(C-11)，27.3(C-12)，62.7(C-13)，138.1(C-14)，122.0(C-15)，23.9(C-16)，49.3(C-17)，38.5(C-18)，29.5(C-19)，27.1(C-20)，78.5(C-21)，37.0(C-22)，15.6(C-23)，19.6(C-24)，27.9(C-25)，15.2(C-26)，55.9(C-27)，13.2(C-28)，27.2(C-29)，14.4(C-30)。以上數據與文獻［12］對比，數據基本一致，故鑒定化合物3為 serrat-14-en-3β，21α-diol。

化合物 4:無色片晶 (丙酮)，mp 280～282℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。與化合物3相比，除H-15化學位移δ 5.33(1H，br s)，H-3α為3.18(1H，dd，J=11.1，4.2 Hz)不變外;1H-NMR不同之處在δ 3.43(1H，br s)所呈現的寬單峰(br s)，提示該化合物H-21為α構型［12］;在13C-NMR譜中，C-21位化學位移比化合物3小約2.00也證實該化合物C-21位與3構型相反，與3是同分異構體;13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:38.6(C-1)，28.1(C-2)，78.8(C-3)，38.2(C-4)，55.7(C-5)，18.9(C-6)，45.2(C-7)，37.1(C-8)，62.9(C-9)，38.9(C-10)，25.4(C-11)，27.2(C-12)，56.9(C-13)，138.5(C-14)，122.1(C-15)，23.9(C-16)，43.4(C-17)，36.0(C-18)，31.2(C-19)，25.2(C-20)，76.2(C-21)，37.4(C-22)，27.6(C-23)，15.4(C-24)，15.7(C-25)，19.8(C-26)，56.2(C-27)，13.3(C-28)，21.8(C-29)，27.7(C-30)。上述數據與文獻［13］對比，數據基本一致，故鑒定化合物4為21-epi-serratenediol。

化合物5:無色塊晶 (丙酮)，mp 316～318℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。與化合物3比較，除1H-NMR δ 4.46(1H，dd，J=11.3，5.1 Hz，H-3α)增大約1.20和在δ 2.05(3H，s)多出一個乙酰基甲基信號外，其 δ 5.33(1H，br s，H-15)，3.23(1H，br s，H-21β)基本不變，在碳譜中多出一個羰基和一個乙酰甲基信號也從側面證明該化合物在C-3位比化合物3多連結了一個乙酰基;13CNMR(CDCl3，100 MHz)δ:37.1(C-1)，27.2(C-2)，80.8(C-3)，37.1(C-4)，57.2(C-5)，18.8(C-6)，44.9(C-7)，38.5(C-8)，62.6(C-9)，38.0(C-10)，24(C-11)，27.5(C-12)，55.8(C-13)，138.1(C-14)，122.2(C-15)，23.8(C-16)，49.5(C-17)，37.9(C-18)，36.1(C-19)，25.2(C-20)，79.2(C-21)，38.3(C-22)，27.7(C-23)，14.6(C-24)，15.8(C-25)，19.8(C-26)，55.9(C-27)，13.4(C-28)，16.6(C-29)，28.1(C-30)，171.0，21.3(3β-OAc)。以上數據與文獻［14-15］對比，數據基本一致，故鑒定化合物5為 serratenediol-3-acetate。

化合物6:無色片晶 (甲醇)，mp＞300℃，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。與化合物4相比，除C-3位1H-NMR譜化學位移δ 4.45(1H，dd，J=11.4，4.9 Hz，H-3α)增大1.20及δ 2.04(3H，s)乙酰基甲基信號外，其 δ 5.32(1H，br s，H-15)，3.45(1H，t，J=4.3Hz，H-21α)基本不變，C-21位的碳譜化學位移數據約比化合物3、5小2.00，進一步證明C-21位為β構型，與化合物5為同分異構體;13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:37.5(C-1)，24.0(C-2)，80.9(C-3)，37.2(C-4)，55.8(C-5)，19.8(C-6)，43.4(C-7)，38.3(C-8)，62.8(C-9)，36.2(C-10)，25.2(C-11)，27.7(C-12)，56.9(C-13)，138.5(C-14)，122.2(C-15)，23.9(C-16)，45.1(C-17)，38.9(C-18)，31.2(C-19)，25.5(C-20)，76.2(C-21)，37.1(C-22)，28.1(C-23)，16.6(C-24)，18.8(C-25)，21.8(C-26)，56.2(C-27)，13.3(C-28)，15.8(C-29)，27.2(C-30)，171.0，21.3(3β-OAc)。上述數據與文獻［15］對比，數據基本一致，故鑒定化合物6為21-epi-serratenediol-3-acetate。

化合物7:無色針晶 (甲醇)，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。在多種溶劑系統下進行TLC比較，其Rf值及顯色與β-谷甾醇對照品一致，故鑒定化合物7為β-谷甾醇。

化合物8:白色粉末，醋酐-濃硫酸反應呈陽性。在多種溶劑系統下進行TLC比較，其Rf值及顯色與β-胡蘿卜苷對照品一致，故鑒定化合物8為β-胡蘿卜苷。

［1］王培善，王筱英.貴州蕨類植物志［M］.貴陽:貴州科技出版社，2001:367.

［2］潘爐臺，趙俊華，孫慶文.貴州藥用蕨類植物［M］.貴陽:貴州科技出版社，2012:30.

［3］羅迎春，趙能武，趙俊華，等.黔產石杉科、石松科藥用蕨類植物的種類和分布研究［J］.安徽農業科學，2008，36(29):12729.

［4］裴 剛，何桂霞，周樸華，等.不同產地皺邊石杉中石杉堿甲的含量研究［J］.中成藥，2003，25(11):891-893.

［5］王 峻，潘勝利.千層塔的23種原植物中石杉堿甲含量［J］.中國藥學雜志，2009，44(16):1212-1214.

［6］王雨鑫，王炳璋，劉振麗，等.高效液相色譜法測定石杉堿甲滴眼液中石杉堿甲［J］.中成藥，2011，33(12):2097-2099.

［7］唐 宇，賀福元，劉 姹，等.正交試驗法優選石杉堿甲胃漂浮片處方的研究［J］.中成藥，2010，32(4):594-596.

［8］馬 燮，劉麗娟，楊 虎，等.微波輔助萃取蛇足石杉總生物堿的工藝研究［J］.中成藥，2008，30(10):1544-1546.

［9］李齊激，鄒 娟，王 沖，等.高效液相色譜法測定昆明石杉中石杉堿甲的含量［J］.時珍國醫國藥，2009，20(8):1961-1962.

［10］Zhang Z，EISohly H N，Jacob M R，et al.Natural products in-hibitingCandida albicanssecreted aspartic proteases fromLycopodium ernuum［J］.J Nat Prod，2002，65(7):979-985.

［11］Zhou Hui，Li Yunsen，Tong Xiaotian，et al.Serratane-type triterpenoids fromHuperzia serrata［J］.Nat Prod Res，2004，18(5):453-459.

［12］Fang Jimmin，Tsai Weiyu，Cheng Yushia.Serratene triterpens fromPinus armandiiBark［J］.Phytochemistry，1991，30(4):1333-1336.

［13］蔣金和，劉 瑩，王利勤，等.蛇足石杉化學成分的研究［J］.云南師范大學學報，2010，30(3):59-65.

［14］裴 剛，周樸華，何桂霞，等.皺邊石杉脂溶性化學成分的研究［J］.天然產物研究與開發，2004，16(3):213-214.

［15］李 軍，韓燕藝，劉嘉森.千層塔中三萜成分的研究［J］.藥學學報，1988，23(7):549-552.