信號肽與分泌通路在畢赤酵母表達異源蛋白中的作用機制

農業部飼料生物技術重點開放實驗室 張 勇 毛若雨 胡小媛

中國農業科學院飼料研究所 滕 達 王秀敏 王建華＊

飼用微生物工程國家重點實驗室 大北農科技集團 王安如＊

大腸桿菌等原核生物表達系統因缺乏翻譯后修飾系統導致諸多必要生物過程無法完成，如蛋白折疊、糖基化、磷酸化、硫酸化、蛋白質順反異構、切除蛋白部分起始序列等，使所得重組蛋白具有不溶、不穩定、無功能性、具免疫源性等缺陷（Idiris 等 ，2010；Daly 和 Hearn，2005；Makrides，1996）。而畢赤酵母表達系統通過特有的翻譯后修飾功能能有效彌補上述大腸桿菌的缺陷，許多在大腸桿菌中難以表達的外源蛋白在畢赤酵母中得以成功表達 （Daly 和 Hearn，2005；Lueking 等，2000；Monsalve 等，1999）。畢赤酵母表達外源蛋白分胞內表達和分泌表達兩種形式（Doyle等，2009；Zhu等，2009），后者更具應用優越性，目的蛋白占分泌總蛋白比例高，有利于下游分離純化（Daly和Hearn，2005）。迄今已有1000余種外源蛋白在畢赤酵母中成功分泌表達，有的表達量高達百分數級，但仍有不少在醫藥、食品、農業等領域有重要價值的蛋白或多肽，如人巨噬細胞集落刺激因子（hGM-CSF）、多巴胺D2S受體等無法實現高效表達（Damasceno 等，2011；Liu 等，2005；Macauley等，2005；Mochizuki等，2001）。 為解決這些問題，科學家從工程酵母構建、載體、啟動子、培養條件、密碼子、前導肽序列、翻譯信號等各方面進行優化改進，取得了良好進展 （Daly和 Hearn，2005）。Idiris等（2010）研究認為，除信號肽外，分泌通路在外源蛋白高效分泌過程中起關鍵作用，因此成為突破蛋白質分泌瓶頸的焦點。本文就畢赤酵母信號肽關聯的分泌機制、結構特征和蛋白分泌通路改造等方面的研究進展作一綜述。

1 信號肽牽引的外源蛋白分泌通路假說

Gunter Blobel于20世紀70年代提出信號肽假說，認為蛋白質合成在核糖體上進行，信號肽作為蛋白質的一個片段引導核糖體定位于內質網通道上，并牽引合成的多肽穿過內質網通道，隨后信號肽被肽酶切除，蛋白質被釋放到內質網腔，由轉運小泡轉運到胞外。隨后20年Blobel小組對這一過程做了深入研究，證實了該假說的正確性和普遍性（Matlin，2011）。畢赤酵母外源蛋白分泌機制符合“信號肽假說”理論，根據蛋白合成初期經胞質到內質網腔轉運途徑不同分為 “共轉運”和“翻譯后轉運”兩種分泌方式。

“共轉運途徑”在所有細胞中普遍存在，通過此途徑分泌的蛋白多為膜蛋白，其信號肽翻譯完成后，信號識別顆粒（SRP）識別信號肽序列和定位于內質網的信號識別顆粒受體，牽引新生肽鏈核糖體復合體至內質網易位子通道 （Idiris等，2010；Kida 等 ，2007；Halic 和 Beckmann，2005；Shan 和 Walter，2005；Mochizuki等，2001）。畢赤酵母表達蛋白多數以“翻譯后轉運”方式分泌胞外，即表達蛋白翻譯后經轉運途徑進入內質網易位子通道，其N端信號肽序列的適度疏水中心具有逃避SRP識別的功能，待分泌蛋白通過與細胞質中伴侶分子結合保持未折疊或松散折疊狀態，在信號肽牽引下與內質網上易位子通道蛋白Sec61復合體結合，與此同時ATP偶聯內質網腔伴侶蛋白Bip通過ATP水解供能結合于多肽，牽引多肽進入內質網腔，信號肽在進入內質網腔過程中被信號肽酶切除掉，而信號肽C端引導肽則在由內質網轉運至高爾基體過程中被位于高爾基體的Kex2 蛋白酶切割掉 （Rapoport，2007；Martoglio 和Dobberstein，1998）。信號肽被切割后，分泌蛋白在內質網腔和高爾基體完成翻譯后加工修飾，如蛋白質折疊、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化等，這些作用伴隨著蛋白質轉運而發生，且蛋白質分泌通路伴侶分子直接參與這些過程，之后成熟肽經轉運小泡分泌到胞外 （Idiris等，2010；Rapoport，2007；Martoglio和 Dobberstein，1998）。

2 信號肽結構特征及其在轉基因事件中的應用

信號肽是由15～50氨基酸組成的可切割序列，主導分泌過程，多位于分泌蛋白N端，也有位于 C 端的 （Damasceno等，2006；Kutay等，1995）。信號肽含三個結構域：帶正電荷N端（1～5 AA，n-region）、疏水中心（7 ～ 15 AA）和作為信號肽酶切割位點的高極性C端（3～7 AA）（Martoglio等，1998；Kutay等，1995）。真核與原核生物信號肽在結構和功能上具相似性，但真核生物信號肽三個獨特結構域肽鏈長度比細菌信號肽稍短（Von，1990）。這三個結構域分工負責完成蛋白分泌。信號肽N端正電荷區域影響蛋白穿膜的啟動分泌，Inouye等（1982）對E.coli脂蛋白N端進行定點突變，使其分別帶上+2，+1，0，-1 個電荷，脂蛋白產量隨電荷數增多而增多，而帶負電荷脂蛋白以未折疊形式存在于細胞質中。此外，“理想”信號肽疏水中心的8～10個Leu也直接影響分泌。Kikucli等（1989）設計 L8、L14、L6 等一系列信號肽觀察信號肽疏水中心Leu含量對人溶菌酶 （hLZM）在釀酒酵母中心分泌效率的影響，發現hLZM分泌效率與信號肽疏水區肽鏈長度或Leu含量有關。C端即為信號肽酶切位點，在其-1和-3位上常見Pro和Gly等一些不帶電荷的氨基酸殘基，被稱為“（-3，-1）-rule”，或有特定的切割支持作用（Martoglio 和 Dobberstein，1998；Nielsen 等 1997；Von，1989）。

迄今在畢赤酵母成功實現外源蛋白分泌表達的信號肽主要類型包括：（1）釀酒酵母α交配因子前導肽（α-MF）；（2）釀酒酵母轉化酶信號肽（SUC2）；（3）畢赤酵母酸性磷酸酶信號肽（PHO1）；（4） 一些蛋白自身信號肽 （Daly 和Hearn，2005；Cereghino 和 Cregg，2000）。不同信號肽對畢赤酵母表達分泌外源蛋白有不同影響，（Damasceno 等，2011；Daly 和 Hearn，2005）。α-MF信號肽在畢赤酵母表達中應用最為成功。α-MF源自于釀酒酵母α交配因子N端85氨基酸前導肽序列，包括N端19氨基酸信號肽和3個天冬氨酸連接糖基化的65肽（Waters等，1988）。關于外源蛋白在α-MF牽引下實現高效分泌表達的研究報道較多。Chandrasekhar等（2010）利用α信號肽成功實現了Insulin在畢赤酵母X-33中高效分泌表達，其產量高達到3.84 g/L；Zhang等（2011）利用含α信號肽的pPICZαA載體成功實現了plectasin及多拷貝基因在畢赤酵母X-33中的高效表達；同時，α信號肽在應用中較其他信號肽更為有效。Ghosalkar等（2008）用IFN-a2 b自身信號肽及α信號肽在畢赤酵母GS115中分泌表達，結果表明，α信號肽引導的目的蛋白高效分泌，產量達200 mg/L，而自身信號肽引導的不能分泌表達。Tanaka等（2004）使用嗜酸性木聚糖酶自身信號肽、α信號肽、酸性磷酸酶（PHO1）信號肽在GS115中分泌表達，結果顯示，α信號肽引導的目的蛋白分泌表達量為其他兩個信號肽的2倍。

酸性磷酸酶信號肽在畢赤酵母異源表達中應用也較多。Eldin等（1997）用酸性磷酸酶信號肽構建pHIL-S1表達載體，實現了單鏈抗體G5 sFv片段在GS115分泌表達，獲純化產品100～250 mg/L。木聚糖酶 （XynI）也通過酸性磷酸酶信號肽在GS115中成功分泌表達，純化后產量達100 mg/L，但其產量略低于 α信號肽 （Koganesawa等，2001）。

大量研究表明，同一蛋白質可通過多種信號肽在畢赤酵母中分泌表達，但表達水平存在差異（Baumgartner等，2002；Koganesawa 等，2001）。 一些蛋白質自身攜帶的信號肽可能更便于在畢赤酵母分泌表達中發揮作用，如Baumgartner等（2002）將攜帶自身信號肽 PHA-E基因插入pPICZB載體并轉化畢赤酵母X-33，植物血凝素表達量達100 mg/L，并具天然PHA-E同等生物活性。此外植物凝集素借助α信號肽也在畢赤酵母實現分泌表達，但目的蛋白氨基端信號肽加工困難，產物無活性（Daly和 Hearn，2005）。盡管諸多外源蛋白質在畢赤酵母成功高效表達，但仍有一些蛋白難以在畢赤酵母中分泌表達、或表達量低、信號肽加工難等 （Chandrasekhar等，2010；Li等，2009；Xie等，2008）。 目前提高外源蛋白在畢赤酵母中分泌表達量是研究熱點，其中信號肽及分泌通路改造是實現高效分泌表達的上游工作（Maresova 等 ，2010；Zhao 等 ，2009；Cereghino 和Cregg，2000）。

3 信號肽及外源蛋白分泌通路改造

3.1 信號肽Kex2切割位點序列改造 信號肽Kex2切割位點序列改造是提高外源蛋白分泌效率的常見策略之一 （Chandrasekhar等，2010；Maresova 等 ，2010；Xie 等 ，2008；Daly 和 Hearn，2005）。異源蛋白畢赤酵母分泌表達依賴于信號肽的牽引作用，后者在分泌過程中被Kex2蛋白酶所切割。該酶是酵母自身編碼的具有Ca2+依賴性絲氨酸蛋白酶，屬枯草桿菌蛋白酶家族，其加工蛋白前體、切除信號肽的特異性酶切位點為Lys-Arg/Arg-Arg/Pro-Ar （Rockwell和 Thorner，2004；Fuller等，1989）。研究表明，Kex2蛋白酶對Lys-Arg-位點的切割效率最高 （Southey等，2008；Bevan 等，1998）。 Bevan 等（1998）對 Kex2 不同切割位點的切割效率進行了研究，結果表明，Kex2對Lys-Arg-位點切割效率比Arg-Arg/Pro-Arg-要高。但Kex2蛋白酶往往由于切割效率不足導致目的蛋白N端帶有未切除完整的信號肽序列（Zhao 等，2009；Kozlov 和 Yagudin，2008；Vedvick等，1991）。相關研究也表明，Kex2酶切位點的前后臨近序列對酶的切割效率有很大影響，優化Kex2切割位點序列可有效提高Kex2切割效率，從而提高目的蛋白產量，該措施在胰島素表達中應用較為成功 （Chandrasekhar等，2010；Wang和Ward，2008；Rozan，2004；Kjeldsen 等 ，1998）。Chandrasekhar等 （2010） 在 pPICZαA 載體 Kex2切割位點KR后添加EEAEAEPK間隔序列，使胰島素前體在畢赤酵母X-33中產量提高2倍。Xie等（2008）在pPIC9K載體Kex2切割位點后也添加相同間隔序列，使胰島素前體在畢赤酵母GS115分泌量增到3.6 g/L。此外，多功能氧化酶、青霉素酰胺化酶、牛胰腺RNA酶A、β乳球蛋白等重組畢赤酵母均有類似酶切序列成功改造的案例。研究表明，在載體Kex2切割位點和目的基因間插入EAEA間隔序列，均能增加Kex2切割效率，提高目的蛋白產量（Garcia 等，2012；Maresova等，2010；Li等，2009；Kim，1997）。但另一衍生問題是由于二肽酶Ste13對EAEA序列切割效率不高，使切割后目的蛋白N端帶有延伸EA序列，多余的EA序列對目標蛋白的結構、功能的影響值得關注。也有研究表明，Kex2切割位點前的序列對于Kex2切割效率有一定的影響，對Kex2切割位點前的序列改造也可有效提高Kex2蛋白酶切割效率，使信號肽切割效率達100%，在緊鄰Kex2蛋白酶切割位點序列前插入四肽序VAVE/VAFE/VAIE，可使信號肽被完全切割 （Wang和Ward，2008）。以上研究表明，信號肽切割位點臨近序列改造的確能提高切割效率。

3.2 分泌通路對外源蛋白分泌效率的影響 外源蛋白翻譯后修飾是伴隨著蛋白分泌過程而發生的，在分泌通路作用下實現蛋白質折疊、二硫鍵形成、磷酸化等翻譯后修飾，這些分泌通路因子大多為內質網腔伴侶蛋白。目前關于內質網腔結合于新生多肽疏水區促進蛋白折疊的伴侶蛋白 Bip、二硫鍵異構酶PDI、伴侶蛋白Sec63及伴侶蛋白輔因子YDJ1p和Ssa1p等對蛋白分泌效率的影響已被證實。PDI作為內質網腔伴侶蛋白，同時也是蛋白質二硫鍵形成異構酶，其與外源蛋白共表達能有效提高外源蛋白分泌量（Idiris等，2010）。 Inan 等（2006）用畢赤酵母X-33表達可作為十二指腸蟲疫苗的美洲板口線蟲分泌性蛋白Na-ASP1，發現增加基因拷貝數反而使Na-ASP1表達量減少，而將Na-ASP1與PDI共表達卻使Na-ASP1分泌表達產量增加，且與Na-ASP1基因拷貝數有一定相關性。為探索各伴侶分子Bip、Sec63、PDI及輔因子YDJ1p和Ssa1p促進外源蛋白分泌效率的差異及互作，Zhang等（2006）分別將類激素蛋白（G-CSF） 分別與 Bip、Sec63、PDI、YDJ1、Ssa1p 在畢赤酵母GS115中共表達，結果G-CSF分別與Bip、Ssa1p、PDI共表達的分泌量提高了4～7倍；將 G-CSF 分別與 YDJ1/PDI、YDJ1/Sec63、Bip/PDI三個基因共表達，使G-CSF分泌產量分別提高8.7、7.6、6.5倍，認為多個伴侶蛋白共表達具顯著的協同作用。

4 小結

綜上所述，畢赤酵母兼具原核表達系統的“高效性”和真核表達系統的“優質性”優勢，是表達各種功能蛋白和多肽的理想平臺。突破蛋白質或多肽在畢赤酵母中高效分泌表達瓶頸往往對功能產物實現產業化至關重要。從受體菌、載體、啟動子、密碼子、培養條件等因素入手均已被證明是提高蛋白分泌效率的有效途徑，但是基于信號肽尤其是信號肽通路元件或結構因子的改造與優化，或許是目前突破表達瓶頸的革命性技術策略之一，今后畢赤酵母高效分泌表達異源蛋白的主攻突破方向包括以下兩點：一是信號肽及分泌通路改造與優化，這一環節為以往同類工作所忽略，既需要基于不同目標蛋白特性的個案研究，更需要積累大量工作以發現新的構效規律，獲得具有普遍性的高效分泌表達的技術解決方案；二是蛋白質翻譯后修飾（蛋白質轉運、折疊、糖基化等）和質量控制系統（QC、UPR），及分泌蛋白的轉運結構因子和輔助條件的系統研究。

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