高效液相色譜法同時測定飼料中多種酚類抗氧化劑和尼泊金酯類防腐劑

樂山市產品質量監督檢驗所 楊春林 李佳峻 胡 強 吳 蔚 呂小艇

脂類氧化酸敗是飼料在加工、儲運和使用過程中發生品質惡化的主要原因之一 （黃濤等，2004）。在飼料中添加抗氧化劑能夠阻止或延緩飼料中某些營養物質氧化，延長飼料貯存時間（張曼等，2006）。可作為抗氧化劑的物質很多，其中沒食子酸丙酯（PG）、叔丁基羥基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）和叔丁基對苯二酚（TBHQ）等酚類抗氧化劑目前應用最為廣泛（楊曉鳳，2011）。除此之外，防腐劑也是常用的保證飼料安全衛生的手段。尼泊金酯（又名對羥基苯甲酸酯）作為常用防腐劑之一，其抑菌范圍廣、毒性低、防腐效率高且防腐效果受pH變化的影響小，是飼料中常用的防腐劑（周建科等，2010）。由于人工合成的防腐劑和抗氧化劑對機體具有不同程度的毒副作用，在飼料中過量使用，會在動物體內造成殘留（鄭萍和陳西平，2008）。目前，酚類抗氧化劑和尼泊金酯類防腐劑的檢測方法主要有高效液相色譜法（曹淑瑞等，2012；胡小鐘等，2000）、氣相色譜法 （李興根和韓世玲，2006）、氣相色譜-質譜法（郭嵐等，2007）、液相色譜-串聯質譜法（汪雋等，2008；林安清等，2007）、薄層色譜法（朱玉和李永紅，1998）及膠束電動毛細管電泳法 （曹小妹等，2012；高勇等，2010；Blanco 等，2009）。這些方法大多只針對其中一類物質的檢測，同時檢測上述兩類物質的方法少有報道。本實驗通過對樣品前處理方法、檢測通道、流動相組成及梯度洗脫程序等色譜條件進行優化，建立了同時測定飼料中4種酚類抗氧化劑和3種尼泊金酯類防腐劑的高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀LC-20A（配自動進樣系統、二極管陣列檢測器），日本Shi-madzu公司；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司；氮吹儀N-EVAP，美國Organomation公司；電子天平DV215CD（精確至0.00001 g），美國O-haus公司；超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司。

甲醇、乙腈（色譜純），美國Tedia公司；標準品：尼泊金甲酯（MHB）、尼泊金乙酯（EHB）、尼泊金丙酯（IPHB）、沒食子酸丙酯（PG）、丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）及特丁基對苯二酚（THBQ），均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。1.2 色譜分析條件 色譜柱：Inertsil ODS-sp C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm）； 流動相：A 為甲醇，B為酸性乙酸銨溶液（pH值為3.5），使用前過0.22 μm 濾膜； 梯度洗脫程序：0～3 min，B為45%；3～8 min，B從45%線性降至 0，保持7 min；15～20 min，B從0線性升至45%，保持7 min。柱溫：40 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣量 20 μL；采用雙通道法分別在波長280 nm和256 nm對兩類物質進行檢測。

1.3 標準曲線

1.3.1 標準儲備液配制 準確稱取尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯及特丁基對苯二酚標準品各10 mg（精確至0.01 mg），用色譜純的甲醇溶解并定容成濃度為200 mg/L的標準儲備液。

1.3.2 標準曲線的建立 取標準儲備液適量用甲醇-乙腈溶液 （30∶70，V∶V）稀釋定容成濃度為0.10、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/mL的工作溶液，取20 μL進樣測定峰面積，以質量濃度對峰面積作曲線。

1.4 樣品處理 準確稱取粉碎后過80目篩的飼料樣品1 g（精確至0.0001 g）于50 mL比色管中，加入3 mL色譜純甲醇充分潤濕后于漩渦振蕩器上振蕩2 min，再加入7 mL乙腈，40℃條件下超聲提取15 min，8000 r/min離心5 min，取上層有機相；重復提取3次，合并有機相，定性濾紙過濾后用0.2 μm針孔過濾器濾于雞心瓶中；45℃條件下用氮吹儀吹至近干，甲醇-乙腈溶液（30∶70，V∶V）溶解殘渣并定容至5 mL，待測。

1.5 回收率與精密度 取粉碎過篩后的均勻飼料樣品3份，加入7種標準品的混合溶液，使其含量分別為10、30、50 mg/kg，按1.4中的方法進行樣品前處理。每個處理重復6次，按1.2中的色譜條件對加標樣品提取液中的7種目標化合物定量，考察方法的回收率和精密度。

2 結果與討論

2.1 色譜柱及洗脫條件選擇 色譜柱的填料組分、粒徑大小、規格型號等因素對目標化合物的保留效果尤其是多組分的有效分離具有重要的影響，所以選擇適合的色譜柱是實現多組分化合物的分離和定量的關鍵步驟。本實驗分別比較了4種色譜柱對7種目標化合物的分離效果，色譜柱Ⅰ：ZORBAX Eclipse Plus C18 （4.6 mm × 100 mm，3.5 μm）； 色譜柱Ⅱ：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；色譜柱Ⅲ：ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；色譜柱Ⅳ：Inertsil ODS-sp C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。在實驗的過程中同時優化確立了甲醇-乙酸銨溶液（用甲酸調節pH至3.5）作為流動相的梯度洗脫程序。結果表明，在優化的流動相條件下，色譜柱Ⅰ的峰形較差且有3種目標物質不能得到基線分離，色譜柱Ⅱ和Ⅲ所得的峰形較色譜柱Ⅰ有一定的改善，但是沒食子酸丙酯與尼泊金甲酯無法完全分離，影響該兩種物質的準確定量，色譜柱Ⅳ能使7種物質全部實現基線分離，峰形尖銳對稱。實驗最后以色譜柱Ⅳ作為色譜柱，采用確立的流動相及梯度洗脫程序對7種物質進行高效液相色譜分離，取得不錯的效果。

2.2 檢測波長的選擇 用二極管陣列檢測器對7種目標物質進行全波長掃描，結果表明，4種酚類抗氧化劑（PG、BHA、BHT、TBHQ）的最大吸收波長均在280 nm附近，而3種尼泊金酯的最大吸收波長在256 nm附近。選擇256 nm作為檢測波長時，3種尼泊金酯的靈敏度較高，但是4種抗氧化劑的響應值非常低（圖1A），導致方法檢出限偏高；而采用280 nm作為檢測波長，則會大大降低3種尼泊金酯的靈敏度（圖1B）。為了使各種目標物質的靈敏度達到最高，我們采用了雙通道法進行檢測，在256 nm波長條件下對尼泊金酯定量，280 nm條件下對酚類抗氧化劑定量，7種物質的雙通道重疊色譜圖見圖1C。

圖1 標準混合溶液色譜圖

2.3 樣品提取條件 樣品的提取條件主要包括提取溶劑的組成與比例、提取的方式、提取時間等因素。其中，提取溶劑的組成與比例不但直接影響樣品中目標組分的提取效率并且對提取液中雜質含量的多少具有決定性作用，選擇適合的提取溶劑對消除雜質干擾和提高回收率具有非常積極的意義。通過渦旋振蕩與超聲波提取相結合的方法，比較幾種常見的提取溶劑對回收率的影響，結果表明，甲醇對飼料中7種目標物質的提取效果均比較理想。但是，研究也發現，飼料中含有的部分脂肪和蛋白質會被甲醇提取出來，會帶來干擾并污染色譜系統。最終采用甲醇-乙腈體系（30∶70，V∶V）作為提取溶劑，利用乙腈對脂肪的弱溶解性及其對蛋白質的沉淀作用來消除部分雜質干擾。應用建立的樣品處理方法和優化的色譜條件對實際樣品進行測定，結果表明，該方法得到的樣品提取液非常干凈，對樣品定量的干擾較小，空白樣品及加標樣品典型色譜圖見圖2。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限 取適量標準儲備液用甲醇-乙腈溶液稀釋定容成濃度為0.10、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/mL 的工作溶液，取20 μL按儀器工作條件測定。以質量濃度對峰面積作校正曲線，得到線性回歸方程，7種物質濃度為0.1～100.0 μg/mL時線性關系良好，相關系數均大于0.9999，線性參數見表1。以3倍信噪比為檢出限（LOD），計算得出6種物質的檢出限分別為0.027～0.102 mg/L。以10倍信噪比計算得出定量限 （LOQ）為0.090～0.332 mg/L。

圖2 某品牌魚飼料空白樣品及加標樣品色譜圖

表1 線性參數、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

2.5 方法的回收率和精密度 采用在空白飼料樣品中添加混合標準溶液的方法，對7種物質進行3個濃度水平的加標回收實驗，每個濃度6次重復，按建立的試驗方法進行處理和分析，考察方法的精密度，結果見表2和表3。7種限量物質添加濃度為10.0～50.0 mg/kg，平均回收率為79.62%～112.29%，相對標準偏差為2.65%～8.38%。

3 結論

本實驗建立了同時檢測飼料中7種限量物質的高效液相色譜方法。實驗以有機溶劑提取飼料中的酚類抗氧化劑和尼泊金酯類防腐劑，利用乙腈對脂肪的弱溶解性和對蛋白質的沉淀作用，有效消除雜質干擾，定性準確。采用雙通道法分別在波長256 nm和280 nm同時檢測，最大限度地保證每種目標化合物的檢測靈敏度。本方法對色譜條件及樣品提取方法進行了優化，具有速度快、靈敏度高、定量準確、操作簡單等特點，可用于飼料中4種酚類抗氧化劑和3種尼泊金酯類防腐劑的同時測定。

表2 飼料中4種抗氧化劑的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

表3 飼料中3種尼泊金酯類防腐劑的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

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