長·效·干·擾·素

王 照，王鐵峰，王鐵成，魏玉榮，黃 耕，5，趙永坤，5，王承宇，5，楊松濤，5，李忠義，5，高玉偉，5，夏咸柱，5

（1．吉林農業大學 動物科技學院，吉林 長春130118；2．軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林 長春130122；3．吉林省地方病第一防治研究所，吉林 白城137000；4．白城師范學院 生物系，吉林 白城137000；5．吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春130122）

干擾素（Interferon，IFN）具有抗病毒、抗細胞增殖、免疫調節等極具醫療價值的功能，已經廣泛應用于肝炎、多發性硬化癥、結核病、布魯菌病等病毒或細菌病。然而由于IFN在動物體內半衰期僅2～3h，不能完全發揮功效，所以基于研究開發長效IFN的臨床需要，研究者們應用多種思維和方法展開工作，主要分為化學修飾法、物理修飾法和生物學修飾法。目前，這些方法都取得了一定的進展。本文綜述了長效IFN的研究現狀，并做出展望，以期對長效IFN的深入研究提供幫助。

1 化學修飾法

化學修飾法可以延長IFN半衰期、提高其生物學活性。目前主要采用聚乙二醇（PEG）化學修飾法，及在此基礎上進行的改造。PEG是環氧乙烷聚合物，經FDA批準可用于藥品、食品、化妝品的生產。PEG通過共價修飾，增加蛋白質顆粒直徑，并對一些不利于蛋白功能長效發揮的表面基團進行覆蓋，在降低藥代動力學的同時提高了藥效動力學。目前，已經有多種PEG修飾的生物藥品獲批準上市，尤其是在肝炎、結核病的防治工作中，常有將PEG－IFN與其他輔助性藥物共同應用的報道。

研究者發現，不同分子量大小的PEG在修飾IFN 時會得到不同的效果，Bansal［1］和 Basu［2］的試驗都證明了大分子量PEG修飾要優于小分子量PEG修飾；Chang［3］用一種叫dock－and－lock的新方法將PEG定點結合于IFN二聚體的兩個特殊蛋白酶結合位點，形成穩定的三聚體，延長了半衰期。dock－and－lock方法是PEG修飾法的一種改進，近兩年在其他醫藥蛋白研究中也有所應用，可能取代單純的PEG修飾IFN，成為一種新的生物醫藥化學修飾法。

雖然PEG修飾法原理簡單，效果理想，但是成本較高，尤其在動物臨床應用中，考慮到經濟效益，更是不利于大量推廣使用，所以該方法目前還主要應用于人醫臨床。

2 物理修飾法

物理修飾法主要是將IFN蛋白嵌于各種微囊、晶體框架等結構內，防止IFN被快速消化降解，達到長期穩定發揮藥效的目的。這種方法除注射途徑給藥以外，還可應用于口服、外用IFN制劑的研發。目前，不斷嘗試新材料、新形式的物理修飾方法已成為IFN研究方向之一。

Li［4］將牦牛的IFN用固體脂質納米粒包裹，體外抗病毒藥效持續長達16d，這種緩釋技術可用于其他動物生物醫藥的研發；Foldvari［5］研發了一種雙相囊泡毫微顆粒，利用該顆粒的三維立體結構可以穿透皮膚角質層的細胞間隙，直接將藥物蛋白送入循環系統，該技術可能給IFN等醫用蛋白藥物的應用提供新途徑；Jiang［6－7］利用懸滴擴散法，輔以金屬離子制備IFN蛋白晶質體，藥效持續超48h，IFN蛋白的生物活性利用率提高了近1．7倍，該方法不需要各種微囊等外源物質，其他功能性蛋白也可以用該方法進行修飾。

物理修飾法中還有研究者進行了靶向性試驗，Giri［8］用經過乳化的多孔層玻璃珠毫微顆粒裝載IFN，同時在顆粒上吸附了有靶向作用的陽離子聚合物，使其靶向性和療效增加了3倍；Jansen［9］將IFN置于唇腭裂手術的人工膠原支架里，緩釋IFN的同時，還提高了藥效發揮效率及靶向性，為需要植入附加器材的臨床治療提供了一個新思路。可見運用物理方法修飾IFN的研究中增加其靶向性將會成為新的研究熱點，但也要注意到新藥品的使用成本可能會偏高。

由近年的報道來看，長效IFN的物理修飾研究正向著具備多重優點的IFN醫用制劑方面發展。這需要醫學和其他領域研究人員的共同努力，加大跨領域的合作研究，相信一定會取得更好的成果。

3 生物學修飾方法

生物學修飾法因其易于優化改進，成本和操作方面優于化學和物理修飾法，所以目前它是長效IFN研究最為深入的方法。生物學修飾法主要有融合蛋白、基因重組、糖基化3種形式。

3．1 融合蛋白 IFN融合蛋白的研發，最初是基于融合蛋白顆粒的空間位阻大，可以降低消化酶的降解作用，減慢機體的排泄濾除速度，從而延長IFN體內半衰期，而目前IFN融合蛋白也開始同時注重靶向性、功能多樣性的研究。

血清白蛋白（Serum Albumin，SA）融合蛋白技術近年來又取得了新的進展。Nelson［10］證明了融合蛋白HSA－IFN在成本低于PEG－IFN的前提下，完全可以取代現有的PEG－IFN。Miyakawa［11］制備鼠IFN－MSA融合蛋白，使鼠IFN效果至少提高3倍。這是繼人血清蛋白與IFN融合后，首次對動物血清白蛋白與動物IFN進行融合研究，表明這種人醫中成功的長效IFN融合蛋白方案也可應用于動物長效IFN的醫藥開發，為人畜共患病的防治工作帶來新的有利工具。還有研究者用PEG對融合蛋白再修飾，半衰期較融合蛋白延長了12～15倍［12］，這個試驗首次將多種技術結合共同開發長效IFN，為進一步研發新型長效IFN開辟了新的思路。

除了血清白蛋白，還有研究將IFN與其他功能性蛋白相融合，制備長效多效IFN。如Vallee［13］報道IFN與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白IFN－Fc；Fioravanti［14］將IFN與載脂蛋白融合，幫助蛋白穿透血腦屏障；Li［15］表達IFN與抗菌肽CM4融合蛋白，使IFN融合蛋白具有了直接抗細菌、真菌的作用；Kim［16］將人IFN－α1的 C末端融合聯入酸性標簽α－核突觸蛋白，提高了IFN保存和運輸過程中的穩定性；Walker［17］將抗血清白蛋白抗體結合域與IFN組成融合蛋白，延長IFN半衰期。同時，在多效長效IFN研究工作中，靶向融合蛋白也是目前研究的一個熱點。Bansal［18］將IFN與具有靶向作用的小肽相連，減少了IFN與非靶向細胞的結合，降低了IFN引發的副作用；同年，Cai［19］制備的半乳糖－人血清白蛋白－IFN 融合蛋白和 Fioravanti［20］制備的IFN－載脂蛋白AⅠ融合蛋白也具有靶向作用。靶向融合蛋白半衰期長，副作用小，治療效果好，但該方法也可能縮減了IFN的廣譜性。值得注意的是，這種靶向性IFN融合蛋白的研究性文章連續兩期在 《Hepatology》雜志上發表［18，20］，可見這種靶向性融合蛋白的研究工作是目前的一個熱點，有深入研究的價值。

總體來說，IFN融合蛋白犧牲了部分藥效動力學而提高了藥代動力學，所以如何調整IFN融合蛋白的藥效動力學與藥代動力學之間的平衡點，最大限度的發揮融合蛋白的臨床作用，也將會成為長效IFN研究的一個重要目標。

3．2 基因重組 通過基因重組方式直接改造IFN，最大限度的保留了IFN的天然生物學特性。Huang［21］和 Hou［22］分別對多組豬、雞IFN－α序列進行分析，重新整合出了優化的豬、雞重組IFN－α，他們的活性與半衰期都優于天然IFN。這種活性的提高可能與受體結合位點的氨基酸的改變或IFN結構的微觀變化有關，在動物與人類IFN中都可以應用。同時，在定點突變技術方面，Yamamoto［23］對人IFN－α上的3個受體結合位點置換突變，改變了其凝集能力和生物學活性，Zhao［24］將 HSA－IFN－α2b中白蛋白亞基的第34位的半胱氨酸突變成絲氨酸，進一步延長了蛋白體內半衰期。

基因重組方法將來的研究趨勢是尋找發現更多的可用于突變重組的氨基酸位點，甚至突破IFN蛋白空間構象的限制，制備出更高活性的長效IFN。

3．3 糖基化 糖基化修飾也可以延長IFN的半衰期，Ceaglio［25－26］在IFN 的4個位點引 入 糖 基 化 后，IFN的半衰期延長了25倍，其生物學特性也有所提高，甚至優于FDA已經批準的佩樂能。但是，糖基化修飾也存在著增加IFN免疫原性，易引發中和抗體反應的不足，需要進一步的研究和探索。

4 展望

近年來長效IFN研究方面取得了長足的進展，尤其是2009年以來，越來越多的報道體現出多種方法相結合，多種學科相結合的理念，表明未來的長效IFN的研制將向著多元化、跨學科的方向發展。今后，在研究長效IFN的過程中，可將思路進一步拓寬，在其他各種藥劑、細胞因子、蛋白及營養物質的保護技術和促吸收技術中尋找可能引以參考并應用于長效IFN開發的相關技術，例如營養學中的惰性蛋白抗消化研究、針對呼吸系統的霧化吸入給藥法等。另外，IFN在使用中有很大的種間差異性，利用長效IFN的優化改良的理念，可能在種間廣譜IFN研究方面也會有所突破，為長效IFN的研究建立新的方向。

［1］ Bansal R，Post E，Proost J H，etal．PEGylation improves pharmacokinetic profile，liver uptake and efficacy of Interferon gamma in liver fibrosis［J］．J Control Release，2011，154（3）：233－240．

［2］ Basu A，Yang K，Wang M，etal．Structure－function engineering of interferon－beta－1bfor improving stability，solubility，potency，immunogenicity，and pharmacokinetic properties by site－selective mono－PEGylation［J］．Bioconjug Chem，2006，17（3）：618－630．

［3］ Chang C H，Rossi E A，Cardillo T M，etal．A new method to produce monoPEGylated dimeric cytokines shown with human interferon－alpha2b［J］．Bioconjug Chem，2009，20（10）：1899－1907．

［4］ Li S，Zhao B，Wang F，etal．Yak interferon－alpha loaded solid lipid nanoparticles for controlled release［J］．Res Vet Sci，2010，88（1）：148－153．

［5］ Foldvari M，Badea L，etal．Topical delivery of interferon alpha by biphasic vesicles：evidence for a novel nanopathway across the stratum corneum［J］．Mol Pharm，2010，7（3）：751－762．

［6］ Jiang Y，Shi K，Wang S，etal．A morphological screening of protein crystals for interferon delivery by metal ion－chelate technology［J］．Drug Dev Ind Pharm，2010，36（12）：1389－1397．

［7］ Jiang Y，Shi K，Xia D，etal．Protein spherulites for sustained release of interferon：preparation，characterization and in vivo evaluation［J］．J Pharm Sci，2011，100（5）：1913－1922．

［8］ Giri N，Tomar P，Karwasara V S，etal．Targeted novel surfacemodified nanoparticles for interferon delivery for the treatment of hepatitis B［J］．Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2011，43（11）：877－883．

［9］ Jansen R G T H，van Kuppevelt，Daamen W F，etal．Interferon－gamma－loaded collagen scaffolds reduce myofibroblast numbers in rat palatal mucosa［J］．Eur J Orthod，2011，33（1）：1－8．

［10］Nelson D R，Benhamou Y，Chuang W L，etal．Albinterferon Alfa－2bwas not inferior to pegylated interferon－alpha in a randomized trial of patients with chronic hepatitis C virus genotype 2or 3［J］．Gastroenterology，2010，139（4）：1267－1276．

［11］Miyakawa N，Nishikawa M，Takahashi Y，etal．Prolonged circulation half－life of interferon gamma activity by gene delivery of interferon gamma－serum albumin fusion protein in mice［J］．J Pharm Sci，2011，100（6）：2350－2357．

［12］Cai Y，Zhang Z，Fan K，etal．Pharmacokinetics，tissue distribution，excretion，and antiviral activity of pegylated recombinant human consensus interferon－alpha variant in monkeys，rats and guinea pigs［J］．Regul Pept，2012，173（1－3）：74－81．

［13］Vallee S，Rakhe S，Reidy T，etal．Pulmonary administration of interferon Beta－1a－fc fusion protein in non－human primates using an immunoglobulin transport pathway［J］．J Interferon Cytokine Res，2012，32（4）：178－184．

［14］Fioravanti J，Medina－Echeverz J，Ardaiz N，etal．The fusion protein of IFN－alpha and apolipoprotein A－I crosses the bloodbrain barrier by a saturable transport mechanism［J］．J Immunol，2012，188（8）：3988－3992．

［15］Li N N，Liu P，Chen S L，etal．Construction and expression of a novel bioactive IFN－alpha2b／CM4fusion protein in Escherichia coli［J］．Microbiol Res，2010，165（2）：116－121．

［16］Kim Y M，Lee H J，Lee J E，etal．Expression of human interferon alpha－1with enhanced stability via the tagging system of a stabilizing peptide［J］．Protein Expr Purif，2009，63（2）：140－146．

［17］Walker A，Dunlevy G，Rycroft D，etal．Anti－serum albumin domain antibodies in the development of highly potent，efficacious and long－acting interferon［J］．Protein Eng Des Sel，2010，23（4）：271－278．

［18］Bansal R，Prakash J，Post E，etal．Novel engineered targeted interferon－gamma blocks hepatic fibrogenesis in mice［J］．Hepatology，2011，54（2）：586－596．

［19］Cai G，Jiang M，Zhou Y，etal．Generation of a liver targeting fusion interferon and its bioactivity analysis in vitro［J］．Pharmazie，2011，66（10）：761－765．

［20］Fioravanti J，Gonzalez L，Medina－Echeverz J，etal．Anchoring interferon alpha to apolipoprotein A－I reduces hematological toxicity while enhancing immunostimulatory properties［J］．Hepatology，2011，53（6）：1864－1873．

［21］Huang L，Cao R B，Wang N，etal．The design and recombinant protein expression of a consensus porcine interferon：Co－PoIFN－alpha［J］．Cytokine，2012，57（1）：37－45．

［22］Hou F，Liu K，Shen T，etal．Antiviral activity of rChIFN－alpha against vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus：a novel recombinant chicken interferon－alpha showed high antiviral activity［J］．Res Vet Sci，2011，91（3）：e73－79．

［23］Yamamoto K，Taniai M，Torigoe K，etal．Creation of interferon－alpha8mutants with amino acid substitutions against interferon－alpha receptor－2binding sites using phage display system and evaluation of their biologic properties［J］．J Interferon Cytokine Res，2009，29（3）：161－170．

［24］Zhao H L，Xue C，Wang Y，etal．Elimination of the free sulfhydryl group in the human serum albumin （HSA）moiety of human interferon－alpha2band HSA fusion protein increases its stability against mechanical and thermal stresses［J］．Eur J Pharm Biopharm，2009，72（2）：405－411．

［25］Ceaglio N，Etcheverrigaray M，Conradt H S，etal．Highly glycosylated human alpha interferon：An insight into a new therapeutic candidate［J］．J Biotechnol，2010，146（1－2）：74－83．

［26］Ceaglio N，Etcheverrigaray M，Kratje R，etal．Novel long－lasting interferon alpha derivatives designed by glycoengineering［J］．Biochimie，2008，90（3）：437－449．