多殺性巴氏桿菌外膜蛋白研究進展

裴志花，曲桂娟，馬紅霞，王 開

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春130118）

多殺性巴氏桿菌（Pm）是有莢膜的革蘭陰性短桿菌，可感染多種動物并引起發病，如禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛和水牛的出血性敗血癥、牛羊的地方流行性肺炎、兔鼻炎以及由于貓狗咬傷導致的人傷口膿腫和腦膜炎等。

根據Pm莢膜和脂多糖的不同，可將Pm分為A、B、D、E和F 5個血清群16個血清型。不同的血清群和血清型引起的疾病不同，如禽霍亂通常由A：1型和A：3型引起，出血性敗血癥主要由B：2型或E：5型引起，豬萎縮性鼻炎主要由產毒素的D型引起。Pm是很多哺乳動物體內普遍存在的條件性致病菌，本病的發生，源于宿主自身條件（物種、年齡、免疫水平）和細菌毒力因子（脂多糖、莢膜、黏附素、外膜蛋白等）相互作用的結果。

1 Pm外膜蛋白及其分類

1.1 Pm外膜蛋白 外膜蛋白（outer manbrance proteins，OMPs）是外膜中鑲嵌的多種蛋白質的總稱。這些蛋白位于Pm和宿主細胞的接觸面上，其功能受到各種選擇壓力的影響，OMPs能從不同程度展示不同菌株間的變化，常用來評定菌株間的差異，從而確定與流行病學的關聯［1］。Pm外膜蛋白作為一種選擇性屏障，可以阻止多種有毒分子進入細菌細胞，這是細菌在多種環境下得以生存的根本保障。此外，外膜蛋白還有很多其他作用，如菌體細胞養分的吸收、運輸分子進出菌體細胞、與宿主細胞的黏附等，在細菌對宿主的感染和致病過程中起著重要作用。

1.2 Pm外膜蛋白分類 Pm外膜蛋白的構成很復雜，根據外膜蛋白在細胞內的拷貝數不同，可分為主要蛋白和微量蛋白，主要蛋白在細胞內的拷貝數可達2×105左右，包括外膜蛋白H（OMPH）、外膜蛋白A（OMPA）、鐵調節蛋白等。微量蛋白種類很多，在細胞內的拷貝數為103～104。根據外膜蛋白的功能不同可分為結構蛋白、轉運蛋白、結合蛋白、黏附素、蛋白質組裝器、膜相關酶等。根據外膜蛋白的結構特征不同可分為：小β－桶膜錨蛋白、非特異性孔蛋白、特異性通道蛋白、能量依賴性運輸通道蛋白、蛋白質分泌孔蛋白、外膜引導蛋白、蛋白質造孔毒素等。另外，OMPs的數量及種類也因菌株和培養條件的不同而有所不同。

2 Pm外膜蛋白的主要功能群

2.1 結構蛋白 Pm具有代表性的結構蛋白主要包括即外膜蛋白A（OMPA）和肽聚糖相關脂蛋白兩大類。

2.1.1 OMPA 蛋白 OMPA 蛋白屬于小β－桶膜錨蛋白，連接著細菌外膜和肽聚糖。Pm OMPA在大腸桿菌細胞內表達的拷貝數可達到105，其表達嚴格受轉錄后水平控制。OMPA蛋白的主要功能包括：（1）細胞穩定劑的作用。OMPA蛋白通過它的C－末端與肽聚糖的相互作用來穩定細胞結構，并參與生物膜的生成。（2）免疫保護作用。OMPA蛋白具有較強的免疫保護作用，能誘導體液免疫和細胞免疫，能夠輔助其他抗原內化和交叉提呈，具有潛在的免疫載體功能。免疫學分析顯示，體內和體外表達的OMPA蛋白均有免疫原性［2］。（3）介導Pm對宿主細胞的黏附和侵襲作用。啟動感染過程。另外，OMPA蛋白還是一種免疫靶標，參與免疫逃避。

2.1.2 肽聚糖相關脂蛋白 肽聚糖相關脂蛋白主要包括肽聚糖相關脂蛋白交叉反應蛋白（peptidoglycan－associated lipoprotein cross－reacting protein，PCP）和P6樣蛋白兩種。

Pm PCP是一種大小為15.6kDa的脂蛋白，與流感嗜血桿菌PCP具有80%的序列相似性，是血清殺菌活性的靶標。PCP與大腸桿菌及多食醋弧菌屬的外膜脂蛋白SlyB蛋白具有相似性。Lo等采用體內表達技術將Pm PCP編碼基因篩選出來，命名為Pm0554，經證實該蛋白在細菌感染過程中表達。用PCP重組疫苗及大腸桿菌系統表達、純化的PCP蛋白免疫雞和鼠，都不能誘導產生針對同源Pm攻擊的保護力。P6樣蛋白，因其編碼基因與流感嗜血桿菌的P6外膜蛋白基因具有高度同源性而得名。研究發現，兔源Pm P6樣蛋白具有抗原性，能誘導禽類產生高滴度抗體，但不能保護它們免受巴氏桿菌感染。P6樣蛋白基因非常保守，雜交試驗顯示，16種血清型的Pm均存在該基因，可用于PCR檢測和核酸雜交檢測。2008年，肖國生等從豬源5：A型Pm Ts－8株中擴增出453bp的psl基因，與禽Pm T16株的psl基因序列只相差2個堿基，同源性高達99%，與流感嗜血桿菌編碼P6蛋白的基因序列同源性為83%［3］。

2.2 轉運蛋白 Pm轉運蛋白主要包括外膜蛋白H（OMPH）和TolC蛋白。

2.2.1 OMPH蛋白 OMPH是Pm最主要的外膜蛋白之一，屬于孔蛋白，是一種通道形成離子載體，其分子量為32－39ku。不同血清型的 Pm OMPH蛋白具有很高的同源性，其異源性主要源于318－333位上部分氨基酸的變異，而大部分的變異又集中在60－80aa和200－220aa兩個不連續的超變區，這兩部分分別與暴露在外表面的2個環形結構相對應。這些結構可能與宿主的免疫系統接觸，并通過變異來逃避免疫監測。

Pm OMPH蛋白能誘導動物機體產生高水平的保護性抗體。Garrido等從A血清群中鑒定了2個OMPH（OMP1和OMP2），經驗證這兩個基因的基因組是連續的并且可以獨立轉錄的。應用fur－OMPH1－OMPH2三重突變株提取的外膜蛋白免疫小鼠，可以保護全部小鼠免受異源強毒Pm感染。將OMP H全基因的N－末端與硫氧還蛋白（Trx）融合表達，可以誘導小鼠產生70%的保護力免受同源菌株的攻擊［4］。郭東春等研究證實鴨Pm重組OMPH蛋白具有良好的免疫學活性［5］。孫穎將Pm OMPH基因重組質粒載入胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）菌影，免疫試驗表明，App菌影裝載pCDNA－OMP H的疫苗對豬App和Pm感染的保護率可達100%［6］。眾多研究結果表明，Pm OMPH蛋白具有很好的免疫原性，使得開發Pm外膜蛋白疫苗成為可能。

2.2.2 TolC蛋白 Tolc蛋白是一個可以排出大分子、小分子、重金屬等“異類”分子的孔道蛋白，是Ⅰ型分泌系統和射流泵的重要成分。TolC蛋白是由3個獨立多肽亞基形成的三聚體孔蛋白，可以通過蛋白質構象的改變，形成一個連續管道將細菌胞漿和外部環境瞬間連通，同時將進入胞漿干擾蛋白質合成的藥物等“異類”分子排出，使菌體內藥物濃度下降，從而介導細菌耐藥。Hatfaludi等鑒定出兩個Pm TolC蛋白質、Pm0527和Pm1980。蛋白質分析顯示，Pm0527和Pm1980與其他藥物外排蛋白同屬于一個TolC家族，任一基因發生突變都會導致Pm對多種化學藥物的敏感性增加［7］。

2.3 結合蛋白 結合蛋白主要指鐵調節外膜蛋白的各個成員，這類蛋白僅在限鐵條件下表達。由于宿主體內轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、結合珠蛋白及血紅蛋白等鐵結合蛋白的存在，體內的游離鐵濃度很低，絕大多數鐵處于螯合狀態。因此，細菌要想感染成功，必須進化成一系列的高親合性的攝鐵系統，與宿主競爭攝取鐵離子復合物，從而獲取鐵滿足自身代謝需要。目前已經確定出三類鐵攝取系統，他們分別利用鐵載體、轉鐵蛋白和血紅蛋白受體，他們的吸收機制也各有不同。

2.3.1 鐵載體受體 鐵載體受體是由細菌細胞分泌的，其功能是從宿主鐵結合糖蛋白上攝取鐵。鐵－鐵載體復合物首先和細菌表面的特異性受體結合，在TonB系統供能的前提下，鐵被運輸到細菌細胞內供其利用。Choi－Kim等報道了3個分子量分別為76kDa，84kDa和96kDa的鐵調節外膜蛋白，這3種蛋白只有Pm培養在無鐵培養基中或在體內生長時才會表達，火雞康復血清可以和這三種蛋白發生反應。

2.3.2 轉鐵蛋白、乳鐵蛋白受體 鐵吸收的第二種機制，是通過菌體表面的鐵結合蛋白受體與宿主的鐵結合蛋白直接作用來攝取鐵。轉鐵蛋白和乳鐵蛋白上鐵的清除需要借助于其受體TbpB/TbpA的參與，并需要TonB系統提供能量，TbpB/TbpA是最主要的轉鐵蛋白、乳鐵蛋白受體。研究顯示，Pm有一個獨特的TbpA受體，不需要第二受體蛋白TbpB的參與就能夠有效的從牛轉鐵蛋白中獲得鐵。2005年，Shivachandra等從水牛（B：2）Pm菌株中擴增出TbpA基因，測序顯示，該基因與A：1型Pm TbpA基因具有98%的相似性［8］。Ewers統計顯示289株豬源和禽源Pm中，均未擴增出TbpA基因。只在牛源、羊源和水牛源的（57.1%）Pm菌株中分離到 TbpA 基因［9］。

2.3.3 血紅蛋白受體 目前，已知的Pm血紅蛋白受體有HgbA蛋白、HgbB蛋白、多重血紅蛋白綁定蛋白、HasR蛋白、TonB絡合物等。HasR蛋白是血色素攝取系統特有的外膜蛋白受體，Prado等從A：3株Pm中鑒定出一個96kD的HasR蛋白，具有很高的免疫原性［10］。TonB絡合物包含 TonB、ExbB和ExbD三種蛋白，鐵主動轉運的動力需要TonB絡合物來提供。其中TonB蛋白是一種能量傳遞器，負責受體在轉鐵蛋白附近的定位，從而促進鐵或含鐵分子與其相應受體的結合，而ExbB和ExbD負責鐵轉運后TonB蛋白的穩定和回收。EbB、EbD和TonB基因的表達水平受鐵調控，都是Pm感染的必需基因，任何一個基因突變或失活都會導致Pm毒力發生改變［11］。

2.4 黏附素 細菌對宿主細胞或細胞外基質蛋白的黏附是細菌進一步在動物體內生長繁殖、引起病理變化的前提條件，是致病的第一步。通常介導細菌黏附作用的黏附素也是潛在的致病因子。很多細菌可以產生黏附素，如流感嗜血桿菌的Hap、Hia/Hsf、HMW1/2、血凝素及菌毛等，致病性大腸桿菌的外膜蛋白OMPX等。

2.4.1 4型菌毛 4型菌毛是Pm的主要黏附素，它能使細菌牢固地黏附于皮膚、呼吸道、消化道、泌尿生殖道的黏膜上皮細胞上。2007年，Siju等克隆到B：2型Pm ptfA基因，測序結果顯示，B：2型Pm ptfA基因與液相色譜法獲得的A：1型ptfA菌毛亞單位蛋白編碼核苷酸的相似性為78.4%，而且前200個核酸序列是完全相同的。利用ptfA重組蛋白兔抗血清，在B：2型、A：1型Pm裂解液中均能檢測到18kD的蛋白質，說明這幾種細菌中均存在4型菌毛［12］。

2.4.2 纖維結合素受體 纖維結合素是一種大分子糖蛋白，分子上有許多細菌結合位點，很多細菌都存在纖維結合素受體，通過其脂質末端與纖維結合素相結合，但結合部位不同。Mullen等通過對Pm DNA噬菌體庫的篩選，獲得分子量為12.7kDa的ComE1蛋白。ComE1是一種公認的纖維結合素受體，重組表達的ComE1主要以GST融合蛋白的形式與可溶的和固態的纖維結合素相結合。透射電鏡技術顯示，ComE1位于Pm的細菌表面，ComE1抗血清可以阻斷多殺性巴氏桿菌與纖維結合素的結合［13］。

2.4.3 絲狀血凝素 細菌的血凝素在細菌的黏附過程中起重要作用，如鼠傷寒桿菌的甘露糖抗性血凝素、百日咳桿菌的絲狀血凝素（FHA）等。Tatum等通過對Pm70基因組序列進行分析，找到2個絲狀血凝素基因，FhaB1和FhaB2，兩基因編碼的蛋白質具有45%的序列相似性。將禽A：3型Pm的FhaB2基因突變后，對火雞進行攻毒，其毒力明顯減弱。將FhaB2血凝素N－末端的三個基因片段聯合表達可誘發火雞產生保護性免疫反應［14］。

2.5 膜相關酶 Boyce等通過分析體外培養的Pm外膜成分，獲得Pm磷脂酶Pm1426，其功能是水解細菌外膜表面的磷脂。重組Pm1426不能誘導雞產生針對同源細菌的保護力［15］。Pm另一具代表性的膜相關酶是唾液酸苷酶，其主要功能是攝取與糖蛋白、糖脂等相結合的唾液酸，來形成自身成分，進而逃避宿主免疫系統的識別。已證實唾液酸苷酶與致病菌的毒力有關，尤其是那些主要侵害或棲息于黏膜表面的細菌。唾液酸苷酶可協助Pm在宿主黏膜細胞定植，某些基因的缺失可導致Pm毒力的減弱和侵襲力的降低［16］。

2.6 其他蛋白 除了上述常見的功能蛋白質外，多殺性巴氏桿菌外膜蛋白還包括蛋白質組裝器、交叉性保護抗原PlpE蛋白等。PlpE重組蛋白是目前發現的第一個可以刺激機體產生針對不同血清型Pm高水平保護性免疫反應的抗原［17］。

近年來人們對Pm外膜蛋白的研究雖然取得了一定進展，但對外膜蛋白詳細認知還遠遠不夠，Pm外膜蛋白的組成、結構和功能是相當復雜的。因此，要詳細了解多殺性巴氏桿菌外膜蛋白的全部組成，以及每一個蛋白質的具體功能，還需要我們不斷地進行努力和探索。

［1］ Hatfaludi T，Al－hasani K，Boyce J D，etal.Outer membrane proteins ofPasteurellamultocida［J］.Vet Microbial，2010，144（1）：1－17.

［2］ 孫?，郭東春，劉家森，等.鴨多殺性巴氏桿菌外膜蛋白A基因的表達及抗原性鑒定［J］.黑龍江八一農墾大學學報，2010，22（2）：52－55.

［3］ 肖國生，曹三杰，黃小波，等.豬多殺性巴氏桿菌5：A型Ts－8株psl基因的克隆和序列分析［J］.河南農業科學，2008，4：108－114.

［4］ Garrido M E，Bosch M，Bigas A，etal.Heterologous protective immunization elicited in mice byPasteurellamultocidafur OmpH［J］.Int Microbiol，2008，11（1）：17－24.

［5］ 郭東春，孫?，劉家森，等.鴨多殺性巴氏桿菌外膜蛋白H基因的表達及抗原性鑒定［J］.中國預防獸醫學報，2010，32（7）：574－576.

［6］ 孫穎.App菌影裝載多殺性巴氏桿菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究［D］.天津：天津農學院，2011.

［7］ Hatfaludi T，Al－hasani K，Dunstone M，etal.Characterization of TolC efflux pump proteins from Pasteurella multocida［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（11）：4166－4171.

［8］ Shivachandra S B，Kumar A A，Amaranath J，etal.Cloning and characterization of tbpA gene encoding transferrin－binding protein （TbpA）fromPasteurellamultocidaserogroup B：2（strain P52）［J］.Vet Res Commun，2005，29（6）：537－542.

［9］ Ewers C，Lubke－becker A，Bethe A，etal.Virulence genotype ofPasteurellamultocidastrains isolated from different hosts with various disease status［J］.Vet Microbiol，2006，114（3－4）：304－317.

［10］Krieg S，Huche F，DiederichsI K，etal.Heme uptake across the outer membrane as revealed by crystal structures of the receptor－hemophore complex［J］.Proc Natl Acad Sci，2009，106（4）：1045－1050.

［11］Krewulak K D，Vogel H J.Structural biology of bacterial iron uptake［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1778（9）：1781－1804.

［12］Siju J，Kumar A A，Shivachandra S B，etal.Cloning and characterization of type 4fimbrial gene（ptfA）ofPasteurellamultocidaserogroup B：2 （strain P52）［J］.Vet Res Commun，2007，31（4）：397－404.

［13］Mullen L M，Nair S P，Ward J M，etal.Novel adhesin fromPasteurellamultocidathat binds to the integrin－binding fibronectin FnIII9－10repeats［J］.Infect Immun，2008，76（3）：1093－1104.

［14］Tatum F M，Tabatabal L B，Briggs R E.Protection against fowl cholera conferred by vaccination with recombinantPasteurellamultocidafilamentous hemagglutinin peptides［J］.Avian Dis，2009，53（2）：169－174.

［15］Boyce J D，Cullen P A，Nguyen V，etal.Analysis of thePasteurellamultocidaouter membrane sub－proteome and its response to the in vivo environment of the natural host［J］.Proteomics，2006，6（3）：870－880.

［16］Tatum F M，Tabatabal L B，Briggs R E.Sialic acid uptake is necessary for virulence ofPasteurellamultocidain turkeys［J］.Microb Pathog，2009，46（6）：337－344.

［17］Wu J R，Shien J H，S hieh H K，etal.Protective immunity conferred by recombinantPasteurellamultocidalipoprotein E（PlpE）［J］.Vaccine，2007，25（21）：4140－4148.