應用現代生物技術和設備測定和評估肝臟的心肌保護作用

劉樹謙

美國西北大學 生物醫學工程系，美國伊利諾斯州 埃文斯頓

0 前言

冠狀動脈病變引起的心肌缺血可導致心肌細胞損傷和心功能衰退，但另一方面可激活心肌保護機制，抑制心肌死亡,改進心肌功能。哺乳動物包括人類有兩種心肌保護機制：心源性的和非心源性的。心源性機制包括保護分子釋放及心肌干細胞激活。在分子水平, adenosine , bradykinin, and opioids等小分子可以快速地(在幾小時內)從損傷的心臟細胞釋放到細胞外間隙, 作用于缺血心肌，激活G-蛋白耦合受體信息通道，進而激活細胞活性刺激分子PI3K和Akt1，引起細胞死亡分子BAD磷酸化，以此抑制心肌細胞死亡[1-6]。隨著小分子的釋放, 損傷心臟細胞及激活的白細胞也可在幾天之內表達多種生長因子，包括成纖維細胞增長因子1和2，血管內皮生長因子，和胰島素樣生長因子。這些因子可激活酪氨酸激酶耦合受體及PI3K-Akt1和MEK-ERK1/2信息通道，進而刺激心肌細胞修復[7-20]。在細胞水平，心肌損傷可激活心源性干細胞。這些細胞可分化成心肌細胞, 進而促進心肌修復，改進心肌功能[21-23]。

非心源性心肌保護機制主要涉及系統器官和組織。骨髓和肝臟是目前發現的主要心肌保護器官。隨著心肌缺血,骨髓可釋放造血干細胞和血管內皮前體細胞于血液循環系統, 部分游離骨髓細胞可以進入缺血性心肌，促進心肌修復[24-27]。與此同時，心肌缺血引起心肌與血液促炎因子如interlekin-6的水平增加。這些因子可作用于肝臟，引發肝細胞表達心肌保護因子，包括-1-acid glycoprotein 2 (AGP2),bone morphogenetic protein binding endothelial regulator (BMPER),fibroblast growth factor 21 (FGF21), neuregulin 4 (NRG4), 和 trefoil factor 3 (TFF3)[53]。這些保護因子可釋放于血液內，作用于缺血心肌，進而減少心肌損傷[28]。肝臟的另一個心肌保護機制是將肝細胞游離和釋放于循環系統[29]。部分游離肝細胞可隨血流進入缺血心肌[30]。這些細胞可能釋放心肌保護因子，提升心肌保護因子的局部水平，因而到達迅速保護心肌的目的[28,30]。這里，作者將主要討論應用現代生物技術和設備對肝臟的心肌保護作用的測定和評估。

1 肝源性心肌保護因子

心肌缺血可導致肝細胞表達心肌保護分泌蛋白因子。這些蛋白因子可以被釋放入血液循環系統，隨血流進入缺血心肌，因而保護心肌，減少心肌損傷[28-29]。這里我們將討論三個問題: 這些蛋白因子是怎么發現的, 蛋白因子的長期心肌保護功能以及作用機制。

1.1 肝源性心肌保護因子的篩選

在小鼠冠狀動脈結扎誘發的心肌局部缺血模型，肝細胞可在一到三天內增進九個分泌蛋白基因的表達，包括AGP2, BMPER, chemokine (C-X-C motif)ligand 13 (CXCL13),FGF21, NRG4, PRG4, serum amyloid A1 (SAA1)和 A2 (SAA2)，及TFF3[5,28]。鑒于這些蛋白在心肌缺血時表達，它們可能包括心肌保護因子。為識別其中的心肌防護因子，我們進行了功能篩選試驗。在冠狀動脈結扎之后，我們對心肌缺血小鼠立即進行肝分泌蛋白靜脈注射(每組小鼠僅注射一種蛋白，50 ng/gm 體重, PBS為對照劑)。SAA1 和SAA2沒有進行篩選試驗, 因為這兩種蛋白經常引起組織淀粉樣病變和組織功能損傷[5,28]。在肝分泌蛋白注射后24 h，小鼠左心室被用于心肌梗塞測試。與PBS比較，注射AGP2,BMPER, FGF21, NRG4, 或TFF3導致顯著心肌梗塞減少。相比而言，注射CXCL13或PRG4沒有引起顯著心肌梗塞改變。這些觀察顯示，AGP2, BMPER, FGF21, NRG4和TFF3有心肌保護的作用。在心肌缺血后一到三天,這些蛋白在肝細胞和血液都顯著增加[28]。而心肌細胞死亡正好發生在這一時期[28]。可見這些蛋白是為心肌保護而生。

在以前的研究中，上述五個分子是從不同的細胞類種被發現的，并有著不同的功用[31]。AGP2，也稱為 orosomucoid 2 (ORM2)，是肝細胞合成的急性炎癥反應血液蛋白。其由201 氨基酸組成，分子量為23.6 kDa。AGP2的表達受多個促炎因子的調控，包括糖皮質激素，IL1，IL6和TNF。AGP2的以知功能包括調控炎癥和免疫反應[32]。比如，AGP2可以抑制T淋巴細胞發育和增長[32]；抑制嗜中性粒細胞活性和增長[33]；抑制血小板聚合[34]；刺激單核細胞和巨噬細胞表達和分泌細胞因子，包括IL1，IL6，IL12 和腫瘤壞死因子[35]；以及刺激成纖維細胞增殖和促進傷口愈合[36]。

BMPER, 也稱為 crossveinless 2, 是由 685 氨基酸組成 , 其分子量為76 kDa。BMPER 最處發現于Flk-1陽性血管內皮細胞。該分子可釋放于細胞外空間,通過與BMP4相互作用來影響細胞的活性[32,57]。 BMP4的作用主要是參與調控Smad信號傳導，控制中胚層發育,促進血管內皮細胞分化和血管形成,以及刺激成骨細胞和軟骨細胞增長。但是,BMP4對BMPER的影響是有爭議的。許多調查表明BMPER抑制BMP4的活性[38-40]，但也有人表明BMPER刺激BMP4的活性[41-43]。最近研究提供了解決這個爭議的證據。BMPER可刺激或抑制BMP4的活性，其影響依賴于BMPER的相對水平。當BMPER的水平超過BMP4，BMPER可掩蓋BMP4受體，從而抑制BMP4的活性。反之,BMPER刺激BMP4的活性[44]。

FGF21是由209氨基酸組成,其分子量為22.3kDa,屬于成纖維細胞生長因子家族[45]。FGF21主要在肝臟表達。胸腺和脂肪組織也有表達,但表達程度較低[6,46]。大多數成纖維細胞生長因子有調節細胞增殖和分化的作用，而FGF21已知參與調節血糖和血脂代謝[47-48]。據報，FGF21有以下具體的代謝功能：[1]刺激細胞的葡萄糖攝取和代謝從而減少血糖水平; [2]誘導胰島素表達和分泌；[3]調節脂肪細胞內脂肪酸代謝；[4]減少血漿低密度脂蛋白和增加高密度脂蛋白水平[47,49-53]。FGF21現已用于治療糖尿病, 血脂紊亂和肥胖的研究。

NRG4, 也稱為 heregulin 4 (HRG4)，由115氨基酸組成,分子量為12.7kDa,主要在胰腺和骨骼肌表達[54]。NRG4是一個細胞膜蛋白，其細胞外領域含有一表皮增長因子的部分。當合成后，NRG4既分布于細胞膜。其細胞膜外部分可由蛋白酶切割游離。游離NRG4可作用于酪氨酸激酶耦合受體HER4,進而調控細胞活性。NRG4的主要功用是刺激ErbB4陽性細胞生長,促進神經元軸突或枝狀突起延伸,調控胰腺島細胞發育[54-55]。

TFF3由80氨基酸組成,分子量為8.6 kDa,主要在胃腸道的杯狀細胞表達。三環狀氨基酸排列為該分子的結構特征。TFF3的主要功用是在生理條件下維持胃腸道黏膜完整性;促進損傷黏膜愈合和修復[56-57]。體外測試證明，TFF3可增強腸道內的黏蛋白聚合，以致形成穩定的胃腸道黏膜層。該黏膜層對胃腸系統有保護作用。

1.2 肝源性心肌保護因子的長期功能

肝源性心肌保護因子的主功能是增加心肌對缺氧的耐受性，減少心肌死亡和改進心肌收縮功能。我們使用組織化學和血液動力學方法評估肝因子對心肌的長期保護作用。當五個肝因子，包括AGP2，BMPER，FGF21，NRG4，和TFF3，按心肌缺血時血液肝因子濃度比注入心肌缺血的老鼠(靜脈注射，每12小時一次，連續注射三天)，心肌梗塞范圍在五，十，和三十天有很大程度減少[28]。連續注射三天的原因是這一期間正是心肌細胞死亡的時間。三天以后開始注射沒有顯著療效。進而，五肝因子注射顯著改進了左心室dp/dt和收縮指數。這些結果支持肝因子的心肌保護作用[28]。有一點應該強調，既然肝臟可產生心肌保護因子，為什么仍然需要注射這些因子來保護心肌。這是因為在心肌缺血以后這些蛋白因子的表達大約需要一天的時間。在這段時間，心肌在肝源性保護因子達到有效水平前已開始死亡。因此，注射心肌防護因子是必要的，而且是越快越好[28]。

1.3 肝源性心肌保護因子作用機制

一個重要的議題是肝蛋白因子如何保護缺血心肌。每一個蛋白因子都有一不同的作用機制。目前，我們已經研究了其中有兩個因子：FGF21和TFF3[58-59]。FGF21可作用于心肌細胞酪氨酸激酶耦合FGF受體 1 (FGFR1)， 進而激活細胞活性刺激分子PI3K和Akt1，引起細胞死亡分子BAD磷酸化[58]。當BAD處于脫磷酸狀態，可與抗細胞凋亡分子Bcl-2和Bcl-XL結合，從而抑制Bcl-2和Bcl-XL的抗細胞凋亡作用，導致細胞死亡增加。相反，當BAD處于磷酸化狀態，Bcl-2和Bcl-XL由BAD釋放出來，不再受BAD的抑制，導致細胞死亡減少，缺血心肌得以保護[30]。TFF3也可激活PI3K和Akt1，但其心肌細胞受體有待研究[59]。 可見，FGF21和TFF3激活細胞內的共同信號傳導途徑。

2 游離肝細胞對缺血心肌的保護作用

心肌缺血可導致肝臟細胞游離并釋放于血液循環系統。部分游離肝細胞可隨血流進入缺血心肌，進而保護心肌[28,30]。這里我們將討論兩個問題：肝細胞是如何釋放的以及肝臟細胞如何保護缺血心肌。

2.1 肝細胞的釋放和調控

隨著心肌缺血的誘發，肝細胞可在三到天五內出現于血液循環系統。一個基本問題是如何確認循環肝細胞。我們建立了一個肝臟細胞特異黃熒光蛋白表達的小鼠模型[29]。循環肝細胞可根據黃色熒光蛋白來辨認。循環肝細胞的數量在心肌缺血后5天內可達到約白血球的1%，之后逐漸減少。部分游離肝細胞可隨血流進入缺血心肌[30]。這些細胞在心肌缺血30天后基本消失。下面， 筆者將主要討論肝細胞是如何游離和釋放的。

缺血心肌以及在心肌病灶內激活的白血球可釋放促炎因子interleukin 6 (IL6)。 該因子可進一步激活循環白血球。這些白血球可粘附于肝臟血管內皮細胞，遷移到肝組織， 表達并釋放基質蛋白酶 2 (MMP2)。MMP2進而分解肝細胞外基質，導致肝細胞游離。游離肝細胞隨血流進入肝中央靜脈及腔靜脈[29]。這些細胞可在靜脈， 肺循環， 左心房， 和左心室系統生存。但是，一但游離肝細胞進入體動脈，這些細胞在動脈血流剪應力的作用下分解。所以， 在周邊動脈和靜脈是很難發現游離肝細胞的[5]。由于冠狀動脈相對較短，進入冠狀動脈的游離肝細胞不會全部被分解，部分細胞滯留于心肌。在心肌缺血誘發五至十天后，IL6和MMP2的表達和釋放減少，肝細胞游離程度下降。

2.2 游離肝細胞對缺血心肌的保護

進入缺血心肌的肝細胞對心肌細胞有保護作用。雖然這些肝細胞如何保護心肌的機制仍未完全了解，但有一點比較明確，既進入心肌的肝細胞可釋放心肌保護因子[28,30]。與釋放于血液比較，直接釋放于局部缺血心肌將迅速提升保護因子的濃度，有利于迅速有效地保護心肌。有一點應該說明，游離肝細胞僅出現于心肌缺血部位，但不出現在正常心肌。對這一現象的機制仍待研究。

3 生物技術和設備的應用

在該項研究中，我們采用了兩種主要生物技術和設備：cDNA microarray analysis 和 flow cytometry。cDNA microarray analysis可用于系統性監測基因在某一細胞種類的表達。通過測定小鼠心肌缺血誘發的肝臟細胞全基因表達， 我們發現了如上所述的九個表達增強的蛋白， 其中包括五個心肌防護蛋白。Flow cytometry 可用于測定細胞種類和蛋白表達.我們就是使用了這個方法發現了心肌缺血時循環的肝細胞。cDNA microarray analysis[60-61]和 flow cytometry[62-64]的技術，設備以及作用原理已在文獻中詳細討論，這里不再重復。可見，這些生物技術和設備在發現肝臟對局部缺血心肌的保護上起了至關重要的作用。

4 結束語

以上研究表明，心肌損傷可誘發系統性自體保護措施。肝臟活化是其中措施之一。肝臟已知有多種功能，如調控新陳代謝、產生膽汁、解毒、和產生血漿蛋白等。除這些功能之外， 肝臟也起心肌保護的作用。這一發現對理解心肌保護機制以及開發心肌保護措施有重要的意義。

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