HPLC-MS/MS法研究大鼠胃內容物對酸棗仁皂苷A的體外代謝作用

馬桂劼，張妍，張明春，2，解軍波，2，*，龐廣昌，2

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

酸棗仁是鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，具有斂汗、養肝、寧心安神等多種功效[1-2]。現代研究表明，酸棗仁皂苷A 是酸棗仁的有效成分之一，具有鎮靜、催眠，降壓、降脂、抗缺氧、增強免疫功能以及對心臟的保護等廣泛的藥理效應，其保健應用前景十分誘人[3-4]。

近年來，有關酸棗仁皂苷A 的研究雖然已有較多的報道，但酸棗仁皂苷A 在機體代謝過程中變化的相關文獻尚不多見[5]，尤其是胃內容物對酸棗仁皂苷A 的代謝情況還未見報道。本實驗通過收集大鼠胃內容物，在體外環境中孵育酸棗仁皂苷A，并采用HPLC-MS/MS技術，對酸棗仁皂苷A 在其胃內容物中的代謝過程進行研究，為闡明該活性成分在胃腸道中的代謝機制及其生物活性作用機理提供一定的理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀：G1312B 二元泵、G1316B 柱溫箱、G1367D 自動進樣器（Agilent，USA）；G6410B Triple Quad LC/MS；Masshunter 色 譜 工 作 站（Agilent，USA）；Waters YMCTMODS-AQ S-5 120A（2.0×100 mm，3.5 μm）色譜柱；BP211D 型十萬分之一電子天平：Satorius（Germany）；ZH-2 型渦流混合器：天津大學無線電廠；酸棗仁皂苷A（純度＞98%）：成都思科華生物技術有限公司；甲醇、水均為色譜純：J.T.Baker（USA）。Wistar 雄性大鼠體重（200±20）g：天津藥物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠胃內容物的制備

健康Wistar 大鼠，試驗前禁食24 h，自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉后，剪取胃，用10 mL 人工胃液（pH 1.0）沖洗并收集胃內容物溶液，4 000 r/min離心15 min，取上清液-20 ℃貯存備用。

1.2.2 色譜質譜條件

流動相為（0.1 %甲酸溶液）-甲醇（50∶50）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min，進樣量為20 μL。電噴霧ESI源，掃描方式：ESI（-），電噴霧電壓：4 000 V，霧化氣體：N2，霧化氣壓力：241.15 KPa；干燥氣體：N2，流速：8 L/min；離子源溫度：350 ℃，碰撞氣體：高純氮氣，碰撞氣壓力：0.15 MPa。酸棗仁皂苷A 質譜分析的條件參數：碎裂電壓360 V，碰撞能量60 V。

1.2.3 對照品溶液的配制

精密稱取酸棗仁皂苷A，以甲醇配制成質量濃度分別為1、2、4、8、10 μg/mL 和20 μg/mL 的對照品溶液。

1.2.4 標準曲線的制備

精密吸取相應濃度的對照品溶液100 μL 于EP管中，揮干，分別加入胃內容物溶液100 μL，渦旋5 min，用流動相溶液稀釋100 倍后，用0.45 μm 濾膜過濾后進行檢測。以峰面積（Y）對酸棗仁皂苷A 濃度（X）作標準曲線，Y=382.17X+0.833（r=0.999 8）。

1.2.5 精密度試驗

按1.2.4 項，制備高、中、低（1、10、20 μg/mL）3 個濃度樣品供試液，并稀釋100 倍后連續進樣5 次，測定藥物濃度，計算RSD 值，分別為2.57 %、2.05 %、2.34 %，表明精密度良好。

1.2.6 穩定性試驗

按1.2.4 項，制備高、中、低（1、10、20 μg/mL）3 個濃度樣品供試液，分別于-20 ℃條件下保存，分別于0～12h 內不同時間點取出，室溫融化后，并稀釋100 倍后依法測定，測定藥物濃度，計算RSD 值，分別為2.87 %、2.51%、1.83%，表明在0～12 h 內穩定性良好。

1.2.7 回收率試驗

按1.2.4 項，制備高、中、低（1、10、20 μg/mL）3 個濃度樣品供試液。每個濃度水平3 個樣品，稀釋100倍后，依法測定其酸棗仁皂苷A 含量（A）。同時測定同濃度對照品溶液中酸棗仁皂苷A 含量（B），按公式回收率=（A/B）×100%，計算相應回收率及其RSD 值。經測定，回收率分別為96.57 %（RSD =1.52 %）、102.30 %（RSD=2.09%）、100.22%（RSD=2.63%），符合方法學的要求。

1.2.8 胃內容物對酸棗仁皂苷A 的代謝作用

精密量取濃度為1.0 mg/mL 的酸棗仁皂苷A 貯備液160 μL 于可密封的磨口玻璃試管中，揮干。于37 ℃孵育活化胃內容物溶液30 min，然后取此液8 mL 加入含藥的玻璃試管中，渦旋10 min 混勻，于37 ℃下培養，分別于0、1、2、3、6 h 時間點取樣，稀釋100 倍后，依法檢測。本試驗以不含大鼠胃內容物的人工胃液（pH 1.0）對酸棗仁皂苷A 進行上述試驗，作為空白對照。

2 結果與分析

2.1 酸棗仁皂苷A 在體外模擬胃內容物中的降解

結果顯示，酸棗仁皂苷A 在胃內容物中的降解反應均迅速啟動，并有明顯的降解趨勢。經過曲線擬合，分別得到C-T 和lnC-T 的擬合方程為Y=-1.815 6 X+18.445（r=0.980 4）和Y=-0.143 8 X+2.954 8（r=0.986 0），可知該反應接近于一級動力學過程，6 h 后其降解百分數為55.63%。通過空白對照試驗得到酸棗仁皂苷A在人工胃液中的降解擬合方程為Y=-0.6379 X+20.057（r = 0.996 4），其降解百分數為19.04 %。由此看出藥物雖在人工胃液的酸性環境下有所降解，但降解速率常數明顯小于其在胃內容物中的降解速率常數（0.637 9 ＜1.815 6），且其降解百分數也小于胃內容物中的數值。由此可以推測，在實驗進行的6 h 內，大部分藥物通過胃內容物作用代謝為其他形式，可能與胃內容物中的微生物作用等相關。

2.2 酸棗仁皂苷A 代謝產物的確定

根據酸棗仁皂苷A 的化學結構推測其可在代謝過程中逐步脫去側鏈上的糖基，推測得到有可能形成的產物結構，并分別計算其分子量。分別取空白樣品溶液和不同時間點的樣品溶液進行HPLC-MS/MS 分析檢測，通過總離子流MS2-Scan 掃描和二級質譜Product Ion Scan 掃描，分別得到代謝產物的母離子與子離子的質荷比m/z，并對其檢測條件進行優化，確定與上述推測結果相符的代謝產物，結果見表1 和圖1。

表1 大鼠胃內容物中酸棗仁皂苷A 及其代謝產物的質譜檢測參數Table 1 Parameter of mass spectra of Jujuboside A and its metabolites in rat’s stomach contents

圖1 M0、M1、M2 和M3 的質譜圖Fig.1 MS spectra of M0,M1,M2 and M3

M0：準分子離子[M-H]-為m/z 1 205.1，其二級質譜生成碎片離子m/z 1 073.2 與749.5。M0與酸棗仁皂苷A 對照品色譜行為和質譜行為完全一致，證明此化合物為母體成分，即酸棗仁皂苷A 藥物原型。

M1：準分子離子[M-H]-為m/z 1 043.4，比酸棗仁皂苷A 的準分子離子m/z 少161.7，推測該代謝物可能在母體成分的基礎上脫去一分子葡萄糖，其二級質譜中生成了碎片離子m/z 911.2 與749.5。M1與酸棗仁皂苷B 對照品色譜行為和質譜行為完全一致，證明此產物為酸棗仁皂苷B。

M2：準分子離子[M-H]-為m/z 911.4，比酸棗仁皂苷A 的準分子離子m/z 少293.7（162+132），推測該代謝物可能在母體成分的基礎上脫去一分子葡萄糖和吡喃木糖，其二級質譜中碎片離子m/z 749.3，為m/z 911.4 脫去一分子葡萄糖后的碎片離子，由此推斷，M2是酸棗仁皂苷A 脫去一分子葡萄糖和一分子吡喃木糖后得到的代謝產物，其結構見圖2。

M3：準分子離子[M-H]-為m/z 471.3，比酸棗仁皂苷A 的準分子離子m/z 少733.8（162×2+132+132+146），推測該代謝物可能在母體成分的基礎上脫去兩分子葡萄糖、一分子吡喃木糖、一分子阿拉伯糖和一分子鼠李糖，由此推斷，M3是酸棗仁皂苷A 脫去糖基后得到的酸棗仁皂苷元，其結構見圖2。

圖2 代謝產物結構式Fig.2 Structure of the metabolites

3 討論

本實驗采用該技術對酸棗仁皂苷A 在大鼠體外胃內容物中的代謝產物進行了定性分析，同時檢測到酸棗仁皂苷A 和3 種相關代謝產物M1、M2和M3。其中M3為皂苷元，初步推測其可能是酸棗仁皂苷A 在胃內容物中的的最終代謝產物。本實驗可以為酸棗仁皂苷A 在體內代謝動力學特征的解析提供初步的理論依據。

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