大孔吸附樹脂純化芡實葉中黃酮類物質

張然，徐燕杰，王晶，王立梅，*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟215500）

芡實為睡蓮科植物芡的干燥成熟種仁。芡實不僅具有食用價值，而且藥用范圍廣泛，屬藥食兩用食品，近年來對芡實進行的大量研究發現芡實含有大量對人體極為有益的成分，如：多糖、維生素、黃酮類化合物、糖苷、生育酚等。芡實葉為芡實加工的副產品，其黃酮類化合物含量較芡實果皮、芡實莖更高[1]，很多研究表明[2-4]黃酮類化合物具有抗炎、鎮痛、抗病毒、舒張冠狀血管等藥理作用。本文利用大孔樹脂分離純化芡實葉黃酮類物質，對充分利用芡實產業副產品、促進芡實產業發展有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

芡實葉：購自蘇州創德興芡實有限公司；蘆丁標準品：北京世紀奧科生物技術有限公司；大孔吸附樹脂（AB-8，D101，HPD100，HZ801）：上海藍季科技發展有限公司；其它試劑均為分析純。

1.1.2 實驗儀器

玻璃層析柱（Ф2×40cm 徑高比1 ∶20）；TDLSO2B臺式高速離心機：上海利鑫堅離心機有限公司；UV 紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；DBS-160F 自動部分收集器：上海精科實業有限公司；恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；循環水式多用真空泵（SHB-ⅢA）；恒溫振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 芡實葉原料預處理

將新鮮芡實葉用0.1%的氯化鈉磷酸水溶液浸泡3 min，放入水中沖淋20 min～30 min，取出切小片陰干后烘干至恒重，研磨粉碎，過60 目篩備用。

1.2.2 大孔吸附樹脂預處理

稱取0.5 BV（bed volume）的大孔吸附樹脂，用1 BV乙醇浸泡樹脂24 h，濕法裝柱，然后用2 BV 的乙醇以2 BV/h 流速通過樹脂柱，浸泡4 h～5 h，再用蒸餾水洗至無白色渾濁現象。用2 BV 的5%HCL 溶液以4 BV/h～6 BV/h 的流速通過樹脂層，并浸泡樹脂2 h～4 h；而后用蒸餾水洗至流出液中性。用2 BV 的2%NaOH 溶液以4 BV/h～6 BV/h 流速通過樹脂層，并浸泡2 h～4 h 而后用蒸餾水洗至流出液中性。

1.2.3 上樣液制備

定量稱取芡實葉粉末干品，按料液比1 ∶25 加入體積分數85%的乙醇，在175 W 的超聲波功率下空化40 min，離心，收集上清液，上樣前用蒸餾水將上清液定容成所需濃度即為上樣液[1]。

1.2.4 標準曲線繪制

精密稱取經105 ℃干燥到恒重的蘆丁標準樣品10.00 mg，用95 % 乙醇溶液定容至100 mL 即得0.10 mg/mL 蘆丁標準溶液。精密吸取蘆丁標準液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5 mL，分別用30%乙醇溶液補充至5mL 再分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，然后分別加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，再分別加入4%NaOH 溶液2 mL，最后分別用30%乙醇溶液稀釋至10.0 mL，放置15 min～20 min 后在該物質的最大吸收峰λ＝510 nm 處測吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得吸光度（A）與蘆丁質量濃度（C）之間的回歸方程為：A ＝10.139C-0.006 4；R2=0.999 6。

用標準曲線法在相同條件下測定各樣品吸光度，同標準曲線方程計算樣品中黃酮類物質含量。

1.2.5 大孔吸附樹脂靜態吸附率測定

準確稱取經處理的4 種不同型號（AB-8，D101，HPD100，HZ801）大孔吸附樹脂（用濾紙吸干）5 g，置于三角瓶中，加入濃度1.0 mg/mL 芡實葉黃酮類物質提取液100 mL，置于搖床中（25 ℃，150 r/min）靜態吸附24 h，過濾；按照1.2.4 方法測濾液的吸光度，計算出C1值。按下式計算各樹脂室溫下的靜態吸附量（mg/g）：

式中：Q 為靜態吸附量，（mg/g）；C0為初始濃度，（mg/mL）；C1為剩余濃度，（mg/mL）；V 為溶液體積，mL；W 為樹脂質量，g。

假設吸附前后溶液體積不變，按下式計算吸附率：

1.2.6 大孔吸附樹脂解吸率測定

取上述吸附飽和的大孔吸附樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，置于250 mL 三角瓶中，加入50 mL 90%乙醇溶液置于搖床中（25 ℃，150 r/min）進行靜態解吸24 h，將樹脂濾出，測定濾液中黃酮類物質的濃度，并按下式計算解吸率：

式中：C2為解吸液濃度，（mg/mL）；C0為初始濃度，（mg/mL）；C1為剩余濃度，（mg/mL）。

1.2.7 芡實葉黃酮類物質純度測定方法

芡實葉黃酮類物質提取液中黃酮類物質濃度乘以提取液體積得芡實葉中黃酮類物質的質量A，然后將該提取液利用電熱恒溫干燥箱干燥，測得產品干燥后的質量B，按下式求出產品中黃酮類物質的純度：

式中：A 為芡實葉中黃酮類物質的質量，g；B 為提取液干燥后的質量，g。

2 結果與討論

2.1 大孔吸附樹脂靜態吸附與解吸試驗

2.1.1 不同大孔吸附樹脂的篩選

不同大孔吸附樹脂的篩選結果見表1。

表1 不同大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮類物質的吸附率及解吸率Table 1 The adsorption and desorption rate of diffrent resins to flavonoids from euryale ferox leaves

由表1 可看出，HPD100 和AB-8 大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率均較高。影響樹脂吸附性能的因素很多，其吸附性能的優劣由其化學和物理結構所決定，樹脂的極性和空間結構（孔徑、比表面積）是影響吸附性能的重要因素。

2.1.2 AB-8 大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學研究

取HPD100 和AB-8 大孔吸附樹脂各5 g，分別加入50 mL 芡實葉黃酮類物質提取溶液，每隔1 小時取1 mL 樣液進行測定，直至達到平衡為止，得到樹脂的吸附動力學曲線，見圖1。

圖1 大孔吸附樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.1 Kinetics curve of static adsorption of macroporous resin

由圖1 可以看出，HPD100 大孔吸附樹脂在起始階段吸附量小，達到吸附平衡時間需6 h，飽和吸附量大；AB-8 大孔吸附樹脂在0 h～3 h 內對芡實葉黃酮類物質的吸附量隨時間的增加而迅速增大，在3 h～5 h內，吸附量的增加不明顯，在5 h 以后，大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮類物質的吸附量幾乎無變化，飽和吸附量略低于HPD100。由于AB-8 大孔吸附樹脂是一種球狀、弱極性吸附劑，屬于弱酸性、弱極性型吸附樹脂[5]，在其結構中僅有非離子化功能基，并附加親水基團以及獨特的加工方法，AB-8 大孔吸附樹脂具有相當大的比表面積和適宜的孔徑，較適于芡實葉黃酮類化合物的純化。且AB-8 大孔吸附樹脂屬于快速吸附樹脂，可以節省時間，縮短生產周期。綜上考慮，選擇AB-8大孔吸附樹脂作進一步試驗。

2.2 大孔吸附樹脂吸附芡實葉黃酮的工藝參數考察

2.2.1 不同上樣流速對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響

取3 BV 芡實葉黃酮類物質提取液（黃酮類物質濃度為3.6 mg/mL），調節pH5，分別以1、2、3 BV/h 的上樣流速進行比較實驗，見圖2。

圖2 不同上樣流速對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響Fig.2 The effect of different adsorption velocity on the adsorption impact of AB-8 resin

由圖2 可以看出，吸附流速為1 BV/h 和2 BV/h時，泄漏點（泄漏點是指該處漏出液黃酮類物質的濃度為上柱前樣液黃酮類物質濃度的1/10，本實驗泄漏點在Y 軸上對應0.36 mg/mL）出現較晚；流速為3 BV/h時泄漏點出現最早。流速1、2、3 BV/h 的泄漏點分別出現在82、65、58 mL 附近。上樣液通過樹脂柱的速度越慢，黃酮類物質越易與大孔吸附樹脂充分接觸，從而提高吸附效果，但隨著吸附流速的加大，泄漏點出現提早，吸附效率隨之降低，這是因為流速過快時，大孔吸附樹脂還未來得及吸附黃酮類物質，黃酮類物質已隨吸附液流出。但是過慢的流速也會降低吸附效率，因為大孔吸附樹脂是一種表面吸附劑，其吸附力與樹脂的比表面積、表面電性、能否與被吸附物形成氫鍵等有關[5]，如果流速過慢則被吸附物質與樹脂之間的作用力會發生變化，影響吸附效果。本實驗綜合考慮工業化生產成本等因素建議上樣流速選用2 BV/h。

2.2.2 不同上樣液pH 對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響

取3 BV 芡實葉黃酮類物質提取液，以2 BV/h 的吸附流速上樣，選擇pH 為4、5、6、7 進行比較實驗，見圖3。

圖3 上樣液pH 值對AB-8 大孔吸附樹脂吸附效果的影響Fig.3 The effect of different initial solution ph value on the adsorption impact of AB-8 resin

由圖3 可以看出，pH 分別為4、5、6、7 的上樣液經過樹脂柱，泄漏點分別在75、83、80、63 mL 附近（泄漏點在Y 軸上對應0.36 mg/mL）。因為芡實葉黃酮類物質有多酚結構，具有較多的羥基，呈弱酸性，故在酸性或弱酸性條件下易被吸附，但酸性較強時黃酮分子易形成“佯鹽”，偏堿性時黃酮分子羥基H+離去，黃酮類物質形成離子結構，且有沉淀物生成，故而都不易被吸附[6]，本實驗結果發現pH 值為5.0 時吸附效果較佳。

2.3 AB-8 大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮的動態解吸實驗

圖4 乙醇濃度對AB-8 大孔吸附樹脂解吸效果的影響Fig.4 The effect of different alcohol concentration on the desorption of resin

2.3.1 不同濃度乙醇對芡實葉黃酮的洗脫效果的影響

選擇3 BV 乙醇溶液對吸附過芡實葉黃酮的樹脂柱進行解吸處理，解吸流速為1BV/h，比較乙醇濃度為10%、30%、50%、60%、80%、90%時的解吸效果，解吸率如圖4 所示：隨著乙醇濃度的增高，芡實葉黃酮類物質的解吸率不斷上升，這一規律與李鳳林利用AB-8 大孔吸附樹脂純化甘薯葉黃酮實驗結果一致[7]，乙醇濃度達到80 %后解吸效果上升不明顯，AB-8 大孔吸附樹脂為弱極性的樹脂，其吸附的黃酮類物質極性較小，故乙醇濃度越高即極性越小則洗脫效果越明顯[8]。考慮到乙醇濃度增大到一定程度后，解吸率提高不明顯，而大量雜質也會隨之洗脫下來，這將使芡實葉黃酮純度下降；綜合考慮，解吸液乙醇體積分數選擇80%。

2.3.2 不同洗脫體積對芡實葉黃酮的洗脫效果的影響

選擇80%的乙醇溶液做為洗脫劑對吸附過芡實葉黃酮的樹脂柱進行解吸處理，解吸流速為1 BV/h，比較洗脫體積為2、3、4、5 BV 時的解吸率，見圖5。

圖5 乙醇洗脫體積對AB-8 大孔吸附樹脂解吸率的影響Fig.5 The effect of different alcohol elution volume on the desorption of resin

由圖5 可知：在起始階段，隨著洗脫體積的增大，黃酮類物質的解吸率增加很快，當洗脫體積達3 BV后，解吸率隨洗脫體積的增加無明顯變化，說明已基本達到解吸平衡。洗脫劑最佳用量的確定，原則是在充分解吸所吸附的物質的前提下，盡量節省解吸劑的用量，因此選定3 BV 作為洗脫體積。

2.3.3 不同解吸流速對芡實葉黃酮的洗脫效果的影響

采用3 BV 的80%乙醇溶液對吸附過芡實葉黃酮的樹脂柱進行解吸，比較解吸流速為0.5、1、1.5 BV/h時的解吸率，間隔10 mL 收集漏出液測定黃酮類物質濃度，結果如圖6 所示。

圖6 不同解吸流速對AB-8 大孔吸附樹脂解吸效果的影響Fig.6 The effect of different desorption velocity on desorption performance

解吸流速為0.5 BV/h 時，峰形寬，峰值低，且拖尾現象很嚴重；解吸流速為1 BV/h 時，解吸較快而且峰值最高，其從峰形、峰值及拖尾現象來看，都與解吸流速為1.5 BV/h 相差不大。解吸流速過快時，解吸性能差，解吸帶寬，且拖尾嚴重，解吸不完全，流速過慢，會延長生產周期。本實驗顯示解吸流速為1 BV/h 效果最佳。

2.4 芡實葉黃酮類物質純度測定結果

按純度測定方法，經計算在芡實葉黃酮提取液中，黃酮純度為18%；通過AB-8 大孔吸附樹脂最佳純化工藝（上樣流速2 BV/h，上樣pH=5.0，以80 %濃度乙醇作為洗脫劑，洗脫體積3 BV，解吸流速1 BV/h）精制后黃酮純度提高到76.5%，是原來的4.25 倍。

3 結論

通過比較AB-8、D101、HPD100、HZ801 4 種大孔吸附樹脂的靜態吸附性能發現AB-8 大孔吸附樹脂對芡實葉黃酮具有良好的吸附性能，用以純化芡實葉黃酮是可行的。

AB-8 大孔吸附樹脂純化芡實葉黃酮的最佳工藝條件為：上樣流速2 BV/h，上樣液pH5.0，以體積分數為80%乙醇進行解吸，洗脫體積3 BV，解吸流速1 BV/h時，純度測定結果表明，經AB-8 樹脂純化后芡實葉黃酮純度為76.5%。

本方法簡單易行，成本低廉，安全可靠，提取的黃酮可作為藥用或開發保健食品；利用大孔樹脂具有穩定性高，吸附容量大，選擇性好，吸附速度快，再生處理方便，使用周期長等優點，有利于工業化生產。

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