核酸與死亡時間的相關性及其檢測方法

張志宏，袁雅潔

（廈門市公安局 刑事科學技術研究所，福建 廈門361003）

死亡時間在法醫學上是指死后經歷時間或稱死后間隔時間（postmortem interval，PMI），即發現、檢查尸體時距死亡發生時的時間間隔。死亡時間推斷即推測死亡至尸體解剖時經歷或間隔時間[1]。目前主要根據尸溫、尸斑、尸僵、角膜改變、胃內容物消化程度、膀胱尿量、尸體昆蟲生長規律等方法推斷早期和晚期死亡時間。但是，這些推斷方法受主觀經驗和客觀條件影響較大，結果存在一定的誤差，難以滿足法醫工作復雜多變的需求。

軀體天然存在的核酸有兩類，一類是脫氧核糖核酸（DNA），存在于細胞核和線粒體內；一類是核糖核酸（RNA），存在于細胞質和細胞核內。軀體死后，組織自溶，DNA降解，直至消失。自然界普遍存在RNA酶，使RNA易發生降解而不適合推斷死亡時間，但是，近年來的研究進展表明，mRNA具有一定的穩定性，其降解過程與死亡時間密切相關[2]。

隨著分子生物學檢驗手段和計算機、光譜等技術的發展及其在法醫學中應用，根據軀體死后DNA和RNA的降解規律，測定組織細胞的核酸含量推斷死亡時間，逐漸成為一種新方法。

1 軀體死后DNA和RNA含量的變化規律

1.1 軀體死后DNA含量的變化規律

國內外學者對軀體死后DNA含量變化做了大量研究，早在1973年Kiliovska等[3]發現豬死后0～72h內，肌肉細胞核DNA含量隨著PMI的延長而有規律下降。1998年Di Nunno等[4]應用流式細胞技術檢測脾組織細胞DNA含量在死后72h內逐漸下降，表明DNA含量與死亡時間有較強的相關性；1999年Di Nunno等[5]將上述研究成果應用于一起槍殺命案，為法醫實踐中推斷死亡時間提供了一種新方法。1999年王慧君等[6]應用流式細胞技術檢測大鼠死后0～96h的骨骼肌、脾、腎細胞DNA含量，發現隨死亡時間延長，各組織細胞DNA完整片段減少、碎片增多。2000年劉良等[7]相繼報道了特殊染色結合計算機圖像分析技術檢測大鼠的腦、肝、腎、脾、肺及心肌等細胞核DNA含量，取得了和上述研究一致的結果。2005年舒細記等[8]應用計算機圖像分析技術檢測32例已知死亡時間的尸體在死后5～36 h腦細胞DNA含量，發現人腦細胞DNA含量隨死亡時間延長有規律下降。2006年羅光華等[9]應用特殊染色結合計算機圖像分析技術研究150例人離體胸骨標本DNA降解與腐敗尸體死亡時間的相關性，發現胸骨骨髓細胞核DNA含量隨著死亡時間延長呈直線相關逐漸下降，死后2周DNA含量達最低值，該方法可以用于晚期死亡時間推斷。2009年刑浩偉等[10]應用改良的Feulgen法結合計算機圖像分析技術檢測大鼠死后35d內肋軟骨細胞核DNA含量，發現死后1～28d，細胞核染色逐漸變淡，至35d時已觀察不到，該方法可以推斷較長的晚期死亡時間。2010年熊平等[11]利用激光共焦顯微拉曼光譜技術，檢測人死后不同時間段腎、肝、脾等組織DNA含量，同樣表明機體死亡后上述組織細胞DNA含量隨死亡時間延長呈線性相關下降趨勢。

以上研究，雖然檢測DNA的方法不同，但都得出相同或相近的結果；即不同的組織器官DNA含量變化與死亡時間的相關性有所差別，相同時間段不同組織器官DNA降解速度有一定差異，但總體而言，DNA含量都隨著死亡時間延長逐漸下降，并呈一定的線性相關。

1.2 軀體死后RNA含量的變化規律

近年來國內外對mRNA與死亡時間的相關性進行了許多研究，表明mRNA具有一定的穩定性且和死亡時間相關[12]。2005年肖俊輝等[13]利用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測大鼠死后肺、胸肌β肌動蛋白（β-actin）mRNA的表達水平變化并對擴增產物進行半定量分析，發現大鼠肺β-actin mRNA于死后12d仍可檢出，胸肌在8d后已無法檢出，β-actin mRNA在肺臟和胸肌的穩定性呈現器官和時間差異性，可為推斷死亡時間提供客觀依據。2007年陳曉瑞等[14]應用復合熒光RT-PCR技術，檢測大鼠死后28h內視網膜細胞β-actin、Pgk1和Rpl4 mRNA的水平，發現上述3個管家基因mRNA隨著死亡時間延長而逐漸降解。2009年任廣睦等[15]應用SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR技術，檢測死后不同時間大鼠腦和脾臟中管家基因GAPDH mRNA及β-actin mRNA的水平，結果表明上述管家基因 mRNA的循環閾值與PMI之間存在顯著的相關性。2011年王克杰等[16]研究表明小白鼠死后即刻至48h腎組織均可檢測到GAPDHmRNA和β-actin mRNA，且其擴增產物呈規律性下降趨勢。

以上研究從半定量到定量對RNA檢測逐步深入，一致表明檢測RNA含量為推斷死亡時間、尤其是晚期死亡時間提供了新方法。

2 DNA和RNA含量的檢測方法

2.1 DNA含量的檢測方法

2.1.1 改良Feulgen染色和計算機圖像分析技術

Feulgen染色是DNA特異性染色方法，其基本原理是利用酸解打斷DNA分子鏈中的嘌呤-脫氧核糖鍵，暴露醛基，醛基與schiff染液反應生成無色反應物，沖洗脫硫，反應物轉化為紅色。應用計算機圖像分析技術獲得積分光密度、平均光度、平均灰度、異型指數等形態學參數，進行統計學分析，測定細胞核DNA含量，并以此推斷死亡時間。王成毅等[17]研究表明腦、肝、腎組織中積分光密度和密度變化數是較好的測量參數，肺組織中異型指數、積分光密度和平均灰度是理想的測量參數，脾臟組織的灰度、色度、光密度等參數與死亡時間的相關性較好。

2.1.2 流式細胞技術（flow cytometry，FCM）

流式細胞技術是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術，能準備地進行DNA倍體分析[18]。Di Nunno等[19]應用該技術對人死后組織細胞DNA含量進行大量研究，發現該技術能準確、敏感檢測到隨死亡時間延長DNA含量的變化，并成功應用到實踐當中。

2.1.3 單細胞凝膠電泳技術（single-cell gel eletrophoresis，SCGE）

2002年Johnson使用SCGE檢測豬死后不同時間組織細胞DNA降解情況，并將該技術應用于法醫學領域推斷死亡時間[20]。2005年何遠[21]詳細報道了SCGE直接檢測大鼠死后肝、脾細胞核DNA降解情況，發現尾長、尾距等參數與死亡時間高度相關，建立的回歸方程對早期死亡時間的推斷很有優勢。

2.1.4 DNA3’末端轉移法（terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）

2005年張嵐等[22]研究大鼠死后不同時間肝、腎、脾組織DNA含量變化，應用DNA3’末端轉移法將dUTP結合到DNA的3’末端，檢測反應剩余的dUTP量，推測DNA的降解情況。研究發現dUTP的剩余量隨死亡時間延長而減少，表明該方法檢測DNA含量可用于早期死亡時間的推斷。

2.1.5 顯微拉曼光譜技術（RAMAN）

激光共聚焦顯微拉曼光譜技術是法醫學領域推斷死亡時間的新方法。拉曼圖譜用散射特征峰的峰位和峰強來確定，不同生物組織的化學基團都有與之相應的散射特征峰，其中1 094cm-1的散射特征峰是DNA骨架磷酸基團亞磷酸離子對稱振動帶，代表核酸。每個散射特征峰的峰強值代表相應化學基團在組織中的含量，通過檢測樣本的拉曼散射特征峰，觀察其峰位、峰強隨死亡時間的變化，用相對峰強比值定量分析組織器官有關化學基團的變化。2011郭萍等[23]應用該技術檢測離體人脾組織，發現48～72h內主要散射峰峰位無明顯變化，而其峰強度有明顯差異；與DNA有關的峰（1094cm-1）強度隨時間推移有明顯下降；各相對峰強（I1094/I2923）隨死亡時間的推移而減小，該方法較好地反應了組織細胞DNA含量的變化。

2.2 RNA的定量檢測方法：熒光RT-PCR

熒光標記逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術在檢測mRNA推斷死亡時間方面，具有靈敏度高、重復性好、自動化程度高的優點。定量PCR選用含量相對豐富、轉錄的RNA較穩定的管家基因作為內參照基因。2009年任廣睦等[15]應用SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR技術，檢測大鼠死后不同時間腦、脾等組織器官中管家基因GAPDH mRNA及β-actin mRNA時序性降解的水平，取得了良好的效果。

3 存在問題和研究前景

檢測DNA降解和RNA降解的方法不同，故不能對各自的檢測數據直接對比，DNA和RNA與死亡時間的相關性可以用各自的擬合方程來衡量，判定系數越接近于1，擬合方程越理想。不同組織器官死后核酸（DNA和RNA）降解存在差異，尋找理想的組織器官作為研究對象，是今后研究應當解決的問題。受諸多因素影響，單一組織器官或單一參數推斷死亡時間可靠性較低，結合DNA和RNA降解規律，優選多個組織器官、多參數，將大大提高推斷死亡時間的準確性和可靠性。

隨著計算機技術和分子生物學檢測手段的發展，其在法醫學領域的應用使得死亡時間的研究深入到細胞分子水平。雖然檢測核酸推斷死亡時間的研究還處于實驗階段，但隨著新理論的提出和新檢測方法的出現，在法醫學領域會有廣闊的研究價值和應用前景。

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