23個STR基因座熒光復合擴增體系的法醫學應用評估

唐建新，李雙琳，劉 宏，翁瑋霞，劉 超，杜蔚安，黃 杰

（1.南方醫科大學 法醫系 廣東 廣州510515；2.廣州市刑事科學技術研究所 廣東省法醫遺傳學重點實驗室，廣東 廣州510080；3無錫中德美聯生物技術有限公司，江蘇 無錫214174）

復合STR分型技術因具有高靈敏度，高鑒別能力以及分型標準化等優點而成為當前法醫學鑒定的主要技術。然而，現在廣泛使用的商品化試劑盒主要針對歐美人群研發，且在Amelogenin缺失的情況下易導致性別誤判[1]，因此，建立適合我國人群的復合擴增體系十分必要。本研究新建立的23個基因座STR復合擴增體系保留CODIS系統中全部基因座，新增PentaD，PentaE，D2S1338，D19S433，D12S391，D2S441，D10S 1248，DYS391，D6S1043九個基因座，具有良好的兼容性、更高的非父排除率和個體識別率。為了評估該復合擴增體系的適用性，本文就其特異性、同一性、準確性、均衡性、靈敏度及對混合樣本、降解檢材、脫落細胞檢材的分析能力及法醫學應用參數進行了評估。

1 材料和方法

1.1 樣本

靈敏度、準確性、均衡性試驗樣本采用標準男性樣本9948。特異性及同一性試驗樣本采用狗、貓、豬、牛、雞、鴨、羊、鼠、兔、魚10種常見動物血痕30份，來源于科研積累；30例（男、女各15例）同一個體肌肉組織、血痕、帶毛囊的毛發樣本，來源于日常檢案積累。案例檢材樣本為脫落細胞檢材30份，降解檢材30份，Amelogenin基因缺失男性樣本3份，來源于日常檢案積累。男女混合樣本制備方案為：濃度為0.05ng/μL、0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.5ng/μL 的 標 準 男 性樣本 9948 分別與濃度為 0.5ng/μL、5.0ng/μL、50ng/μL的標準女性樣本9947A等體積混合，得到男女DNA比例為 1∶10，1∶5，1∶2.5，1∶1，1∶100，1∶50，1∶25，1∶10，1∶1000，1∶500，1∶250，1∶100 的混合樣本。 群體遺傳學調查樣本為196份廣州漢族無關個體血痕。

1.2 主要儀器和試劑

EQ1000法醫提取試劑盒（北京東勝創新生物科技有限公司），AGCU Expressmarker 23熒光檢測試劑盒及相應的SIZ-500內標（無錫中德美聯生物技術有限公司）。Freedom EVO全自動化工作站平臺，ABI9700型擴增儀，ABI3130XL全自動遺傳分析儀

1.3方法

1.3.1 DNA提取

采用基因組Freedom EVO全自動化工作站以磁珠法提取基因組DNA，磁珠提取試劑盒為北京東勝創新生物科技有限公司的EQ1000法醫提取試劑盒。

1.3.2 PCR擴增

應用25μL標準體系進行擴增：特異性測試、同一性測試、靈敏度測試、疑難檢材測試所用體系為：PCR 反應液 10.0μL，引物混合液 5.0μL，C-taq 1.0μL，templete 1.0μL，sdH2O 8.0μL。混合樣本測試所用體系為：PCR 反應液 10.0μL，引物混合液 5.0μL，C-taq 1.0μL，模板 2.0μL，雙蒸水 12.0μL 擴增應用 ABI9700型擴增儀，熱循環條件： 95℃ 2min；94℃ 30s，60℃ 1min，72℃1min，10 個循環； 90℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 10min，20個循環。

1.3.3 電泳與分型

取1.0μL PCR產物加入12μL Hi-Di甲酰胺和0.5μL內標的混合液中，在AB 3130XL遺傳分析儀上進行毛細管電泳。使用GeneMapper ID3.2軟件進行基因分型。

1.3.4 統計

采用powermarkerV3.25計算雜合度觀察值（H），多態信息含量（PIC），使用powerstate計算個人識別率（DP），非父排除率（PE）。

2 結果

2.1 靈敏度檢測

25μL體系中，加1μL模板，模板濃度及擴增結果（見圖1）。分型結果顯示模板濃度在0.05～1.00ng之間時，擴增均衡性、峰高符合要求。

2.2 準確性及均衡性檢測

檢測標準男性樣本9948，各基因座等位基因分型準確，無重疊，無明顯偏離，峰高均在200RFU以上，雜合子兩峰的峰高比例均大于70%，峰值均衡。與商品化試劑盒Sinofiler比較，效果相當。

2.3 男女混合樣本檢測

女性樣本9947A為50ng時，含0.05ng男性樣本9948的混合樣本檢測不到AmelY，DYS391；含0.1ng男性樣本9948的混合樣本能檢出男性成分；含0.2ng男性樣本9948的混合樣本能檢出Amel Y（RFU=54），含0.5ng男性樣本9948的混合樣本能檢出Amel Y（RFU=177）及 DYS391（RFU=128）。

圖1 靈敏度測試分型圖譜

女性樣本9947A為5ng時，按0.05ng 9948∶5ng 9947混合，9948只能檢測出 DYS391（RFU98） Amel（RFU95），常染色體檢測不到；按 0.1ng 9948 ∶5ng9947混合，檢測出 DYS391（RFU=441）， Amel（RFU=297），常染色體檢測不到；按0.2ng9948∶5ng9947混合及0.5ng 9948∶5ng9947，9948時，能檢出為混合樣品。

女性樣本9947A為0.5ng時，所有混合樣品均能檢測出男性成分。

2.4 特異性、同一性檢測

對狗、貓、豬、牛、雞、鴨、羊、鼠、兔、魚 10 種常見動物血痕DNA復合擴增后，均未檢見特異分型。檢測已知同一男性個體肌肉組織、血痕、帶毛囊的毛發，均獲得完整分型，無等位基因丟失及分型錯誤。

2.5 案例檢材檢測

對脫落細胞檢材30份，降解檢材30份進行分型，結果表明所有分型與Sinofiler分型結果一致（見圖2～3）。

圖2 脫落細胞檢材EX23復合擴增體系STR分型

圖3 降解檢材EX23復合擴增體系STR分型

2.6 缺少牙釉基因的男性樣本檢測

檢測3例Amel Y丟失的男性樣本。使用EX23進行擴增，電泳后結果顯示Amel Y未檢測出分型，DYS391均成功分型。

2.7 多態性檢測

對廣東地區漢族無關個體血痕196份進行DNA分型，統計結果顯示除性別判斷位點以外基因座的基因型分布符合H-W平衡（P＞0.01），雜合度觀察值（H）在0.658～0.898 之間，多態信息含量（PIC）在 0.378～0.865之間，累計個人識別（TDP）率達0.999999999，三聯體累計非父排除率（CPE）達0.999999997。

表1 廣東漢族人群23個STR基因座的法醫學參數

3 討論

在不同的地區和人群，STR基因座頻率具有明顯的差異[2]，因此不同的STR基因座往往被選擇性地使用[3]。最近，美國FBI對13個CODIS基因座重新進行了評估，并最終確立了含20個STR基因座的擴展核心基因座[4-5]。

本文采用的復合擴增體系與以往的試劑盒相比，一個明顯變化是在常染色體位點中新增了DYS391基因座用以輔助判斷性別、提高分辨能力。現在廣泛使用的商品化試劑盒均借助Amelogenin基因判斷性別。通常AMELX的丟失變異不會導致性別的錯判，而AMELY染色體的片段缺失、引物結合區的突變均將導致性別判斷錯誤[6]。不同人群AMELY分型失敗的頻率差異較大，最高的是斯里蘭卡，為8.3%，最低為意大利，僅0.008%[7]。中國男性群體中AMELY分型失敗率為0.085%，可能的原因為Yp11.2的缺失而非引物結合區突變，且這種缺失無規可循[8]。為了避免性別錯判，新試劑盒增加DYS391后，可以有效避免Amel Y丟失造成的性別誤判。此外，對該復合擴增體系進行靈敏度檢測時，當模版量為0.03ng時，雖然可檢出全部基因座，但均衡性較差，D3S1338的雜峰干擾結果判讀。因此，使用該復合擴增體系檢測極微量檢材時，應留意雜峰的干擾。

綜上所述，本文采用的23位點復合擴增體系在常染色體位點中加入了Y染色體位點，提高了性別判斷的準確性，與以往單純依靠Amelogenin基因相比具有很大的改進；在體系檢測中，各項性能指標均符合法醫DNA檢驗的需要，可以應用于法醫學實踐。

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[6]Karl Zehethofer，Burkhard Rolf.A molecular analysis of three amelogenin negative males in two routine paternity test[J].Forensic Sci Int Genet， 2011，5（5）：550-551.

[7]Takayama T，Takada N，Suzuki R，etal.Determination of deleted regions from Yp11.2 of an amelogenin negative male[J].Legal medicine，2009，11（SUPPL.1）：S578-S580.

[8]陳愛萍，陳勇，王會品，等.中國人群Amelogenin基因的突變頻率和突變類型[J].中華醫學遺傳學雜志，2007，24（6）：615-619.