發菜中三苯甲咪唑氨基酸抗氧化和紫外吸收性質的研究

劉榮，于海峰

（1.榮成檢驗檢疫局，山東榮成264300；2.齊魯工業大學食品與生物工程學院，山東濟南250353）

三苯甲咪唑氨基酸（mycosporine-like amino acids，MAAs）是一類水溶性、小分子（＜400 Da）、具有紫外吸收特性的化合物[1]。它是以環乙烯酮為基本骨架，與氨態氮或亞氨基醇共軛組成的，由于側鏈和取代基的不同，不同結構的三苯甲咪唑氨基酸的波長吸收范圍也有所不同[2]。三苯甲咪唑氨基酸在微生物界的分布是非常廣泛的，在細菌、真菌、藍藻、浮游植物和大型藻類中都發現三苯甲咪唑氨基酸的存在[3]。目前前對于三苯甲咪唑氨基酸的研究主要集中于環境因素（紫外輻射強度、溫度、鹽度等）對藻類積累MAAs 的影響、紫外線對MAAs 的誘導及MAAs 的分布等方面。對這類紫外線吸收物質的應用研究只是剛剛起步，其研究范圍和深度都不夠。國內對該領域的研究報道很少，本論文以液體懸浮培養的發菜細胞為原料，確定了其含有MAAs，研究了MAAs 化合物的紫外吸收及抗氧化的性質。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

發菜細胞（Nostoc flagelliforme），由齊魯工業大學藻類生物技術研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 MAAs 粗提物的制備

將發菜與甲醇按1 ∶4（g ∶mL）的比例進行提取，初始pH 為2、溫度45 ℃、提取時間2 h。收集上清液，冰箱中放置24 h。過濾，旋蒸（45 ℃、50 r/min），將濃縮物按水∶氯仿的比例為2.5 ∶7.5（體積比）加入氯仿，取上層水溶液離心，冷凍干燥后即得MAAs 粗品[4]。

1.2.2 清除羥基自由基能力的測定

該實驗采用H2O2/Fe2+體系。將1 mL 9 mmol FeSO4、1 mL 9 mmol 水楊酸-乙醇與不同濃度的MAAs 溶液混勻，37 ℃水浴30 min，5 000 r/min 離心5 min，加入1 mL 9.8 mmol H2O2啟動整個反應。510 nm 下測定添加不同濃度MAAs 溶液的吸光值[5]。清除率的計算公式：

式中：A0為空白參比液的吸光值；AX為加入MAAs 溶液后反應體系的吸光值；AX0為MAAs 溶液的本底吸收值。因待測反應體系本身存在著吸光值，該試驗中以1 mL 9 mmol FeSO4、1 mL 9 mmol 水楊酸-乙醇、1 mL MAAs 溶液和1 mL 蒸餾水作為待測溶液的本底吸收值。

1.2.3 清除超氧離子能力的研究

取4.5 mL pH 8.2、濃度50 mmol Tris-HCl 緩沖液，15 μL 蒸餾水，搖勻，25 ℃水浴20 min，分別加入1 mL不同濃度的MAAs 粗品溶液，再加入15 μL 預熱過的（25 ℃）鄰苯三酚（3 mmol，用10 mmol HCl 配置）。混勻，測定325 nm 下MAAs 溶液的吸光度值[80]。每30 s測定一次數值，以每分鐘的樣品溶液吸光度增加值來計算MAAs 的清除率。清除率的計算公式：

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔA 為加入MAAs 溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.4 MAAs 紫外吸收能力的鑒定

稱取MAAs 粗提物0.05 g，將其與防曬系數為20的防曬乳霜按質量比1 ∶1、1 ∶2 的比例混合均勻，分別溶入20 mL 水中，于280 nm～400 nm 波長范圍內進行光譜掃描，以未添加MAAs 粗提物的防曬乳霜做空白對照[6]。

2 結果與分析

2.1 MAAs 對超氧陰離子清除能力的測定

MAAs 對超氧陰離子的清除效果見圖1。

圖1 MAAs 清除超氧離子能力的研究Fig.1 The superoxide anion scavenging activity of MAAs

在堿性環境下鄰苯三酚能夠迅速發生氧化，釋放出超氧陰離子，進而生成有色的中間產物。加入抗氧化物質能夠使溶液體系顏色變淺，325 nm 處吸光度降低。試驗結果表明MAAs 具有清除超氧陰離子的作用。其清除作用隨MAAs 濃度的增大而增大，當MAAs 濃度為7.05mg/mL 時，對超氧陰離子的清除率為59.01%。需氧生物體內95%的氧分子可以作為電子受體在物質代謝過程中發揮作用，最終被還原成水，而剩余的5%則在還原過程中由于接受的電子數目不等從而形成了多種性質活潑的活性氧，氧分子受單一電子還原的產物稱為超氧陰離子。定量的超氧陰離子對于細胞來說是無害的，但過量即可造成組織損傷。紫外脅迫是一種重要的外源氧化應激因素，超氧陰離子就是細胞受到紫外輻射后的一種產物，并進一步氧化成過氧化氫等其它自由基，對細胞造成傷害[7]。因此，細胞內MAAs 含量的增加是發狀念珠藻響應紫外脅迫的一個重要機制，它在短時間內能夠有效地保護細胞避免受到過多的傷害。

2.2 MAAs 對羥基自由基清除能力的測定

MAAs 對羥自由基的清除效果見圖2。

圖2 MAAs 清除羥基自由基能力的測定Fig.2 The hydroxyl radical scavenging activity of MAAs

采用可見光分光光度法在510 nm 處測定MAAs對羥自由基的清除能力。反應體系中，水楊酸能夠捕捉Fenton 反應生成的羥自由基生成2，3-二羥基苯甲酸，然后通過分光光度法測定2，3-二羥基苯甲酸的量間接的測定羥自由基的生成量。

由圖2 可知，MAAs 具有清除羥自由基的能力，隨濃度的增大其清除效果越明顯。當濃度為30.78 mg/mL時，清除率可達到78.64%。羥基自由基也是基體受到紫外脅迫后的一種產物，是活性氧中最活潑的自由基，也是活性最大的自由基，幾乎可以和細胞中的任何分子發生反應，對蛋白質、核酸、糖類和脂類都有損傷。MAAs 對羥自由基的清除作用進一步表明MAAs的生成能夠有效地保護細胞免受紫外的過多脅迫。

2.3 MAAs 抗紫外吸收能力的鑒定

MAAs 的紫外吸收效果見圖3。

圖3 MAAs 粗提物與防曬霜（SPF20）混合后紫外吸收能力的測定Fig.3 The absorption spectrum of mixture with different amount of MAAs with SPF20

從圖3 我們可以看出防曬乳霜及其與MAAs 粗提物混合物在200 nm～400 nm 波長范圍內的吸光度。較純的防曬乳霜添加MAAs 粗提物后的樣品組吸光值在所測得波長范圍內都有所增加。防曬乳霜吸收紫外的能力主要集中在280 nm～360 nm 處，而添加MAAs粗品后，防曬乳霜的紫外吸收能力在整個波長范圍內都有顯著的提高。由此可以表明，MAAs 對防曬用品的防曬能力具有促進作用。

3 結論

MAAs 具有一定的抗氧化能力。MAAs 對超氧陰離子和羥自由基的清除作用隨濃度的增大而增大，MAAs含量的增加是發菜響應紫外脅迫的一個重要機制，它在短時間內能夠有效地保護細胞避免受到過多的傷害。防曬乳霜吸收紫外的能力主要集中在280nm～360nm處，而添加MAAs 粗品后，防曬乳霜的紫外吸收能力在整個波長范圍內都有顯著的提高，說明MAAs 具有有效的防紫外線能力。在防曬要求日益提高的今天，MAAs 可作為一種較理想的防曬護膚物質。

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