食品中沙門氏菌的NASBA快速檢測技術

鐘響，劉寧，尹偉力，耿金培，粟智平，段效輝

（煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000）

食品安全問題中最常見卻最易被忽視的原因就是食物被致病性細菌污染。根據《衛生部關于2012年全國食物中毒事件情況的通報》[1]，微生物性食物中毒事件的報告起數和中毒人數均為最多。沙門氏菌是最重要的食源性致病菌中之一，屬于腸桿菌科，是肉及肉制品、蔬菜甚至水產品感染的重要來源。我國沙門氏菌的檢驗方法多采用傳統方法，操作繁瑣，耗時較長，很難適應食品安全和公共衛生事件應急處理快速反應的需要；同時，由于沙門氏菌屬有2000種以上的血清型，生化反應、血清學反應多有交叉，因此傳統檢測方法在特異性和敏感性上也有其局限性[2-3]。

NASBA （nucleic acid sequence-based amplification）技術，即依賴核酸序列的擴增技術，是在PCR基礎上發展起來的一種擴增RNA的新型分子生物學檢測技術。NASBA技術操作簡便，不需要特殊儀器；不需要溫度循環，42℃2 h左右可將模板擴增109～1012倍，靈敏度高；由于外源雙鏈DNA無T7啟動子序列，不會被擴增，大大提高了NASBA反應的特異性[4-5]。NASBA已成功應用于禽流感、麻疹病毒、帶狀皰疹病毒、輪狀病毒、丙肝病毒、口蹄疫病毒、草莓斑駁病毒等多種病毒檢測[6-13]，但在DNA病原菌檢測中的研究甚少。本研究將NASBA技術用于食品中沙門氏菌的檢測，可縮短檢測周期，提高檢出率，為進出口和國內食品安全提供強有力的技術保障。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium ATCC 14028，甲型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphi A ATCC9150，大腸埃希氏菌Escherichia coli ATCC25922，金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC25923，均來源于美國典型培養物保藏中心。

1.1.2 主要試劑

細菌總RNA提取試劑盒：商品名E.Z.N.ATM，美國Omega公司；T7RNA聚合酶（20 U/μL）、RNAseH（5U/μL）、AMV（20 U/μL）、NTP（4×25μmol×100 mM）、dNTP（4×10 mM each）、RNA Laddder、引物（上海生工），RNasin（40 U/μL）、6×RNA Loading buffer、50×TAE、EB：北京鼎國培養基等：北京陸橋。

1.1.3 主要儀器

PTC-200型PCR基因擴增儀：美國MJ公司；BioPhotometer核酸蛋白分析儀：德國eppendorf；多用電泳系統PROTEAN II：美國BIO-RAD；凝膠成像系統Alpha Imager2200：美國 Alpha Innotech。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

依據沙門氏菌屬invA基因保守序列設計引物，序列如下（畫線部分為T7 RNA聚合酶結合位點）：

SM-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG CTGCGGTATTCGTGACTT-3’

SM-R：5’-GTGGTGGTCGCAGTTG-3’

1.2.2 總RNA的提取

按照細菌總RNA提取試劑盒E.Z.N.ATM說明提取細菌總RNA，測定OD值，評價RNA質量。

1.2.3 NASBA擴增

1）在25μL擴增體系中加入 AMV反轉錄酶Buffer（5×）5μL，T7 RNA 聚合酶 Buffer（5×）5μL，RNaseH Buffer（10×）2.5μL，RNasin（RNA 酶抑制劑，40 U/μL）0.5μL ，上、下游引物（15μmol/L）各 1μL，RNA 模板 2μL；置于 65℃、5 min，使 RNA 解鏈；然后立即置于42℃、5 min。

2）迅速加入 T7 RNase（20 U/μL）2μL，AMV 逆轉錄酶（20 U/μL）0.4μL ，RNaseH（5 U/μL）0.05μL，無菌ddH2O補至25μL；小心混勻并輕微離心，置于42℃中孵育90 min；反應完成后立即將反應管置于-20℃終止反應，備用。

1.2.4 電泳及結果記錄

將冷卻的NASBA產物點樣于2.0 g/L瓊脂糖凝膠，置于1×TAE緩沖液中，5 V/cm電壓電泳20 min，EB染色10 min，在凝膠成像系統下觀察并記錄結果。

1.2.5 特異性試驗

取鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，甲型副傷寒沙門氏菌ATCC9150，大腸埃希氏菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，按1.2.3和1.2.4進行特異性反應。

1.2.6 靈敏度試驗

將提取的細菌總RNA稀釋成同樣濃度40ng/μL，用 DEPC 處理滅菌水稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個梯度，分別進行NASBA擴增，試驗步驟同1.2.3和1.2.4。

1.2.7 人工污染樣品驗證試驗

1.2.7.1 人工污染樣品

按表1所示人工污染9份樣品。

表1 人工污染樣品情況Table 1 Artificially contaminated samples

1.2.7.2 樣品的增菌

各取樣品25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水，36℃培養18 h～24 h。

1.2.7.3 NASBA擴增及菌種鑒定

將上述增菌液提取總RNA，進行NASBA擴增，電泳觀察結果。同時按照GB 4789.4-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》進行沙門氏菌鑒定。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗

以鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌總RNA及無菌水（CK）作為模板，加入引物SM-F/SM-R，進行NASBA試驗，結果見圖1。結果顯示，該對引物只有在模板為沙門氏菌屬的擴增反應中出現明亮的條帶，大小約為277 bp，并且兩種沙門氏菌均能夠擴增，而其余3種RNA未出現擴增信號，結果與預期相符，表明引物SM-F/SM-R的特異性較強。

2.2 靈敏度試驗

圖1 沙門氏菌特異性試驗NASBA擴增結果Fig.1 The specificity test of Salmonella

從鼠傷寒沙門氏菌中提取的總RNA濃度為54.6ng/μL，稀釋后濃度為：5.5ng/μL、550 pg/μL、55 pg/μL、5.5 pg/μL、550 fg/μL。分別用這些 RNA 作模板、SM-F/SM-R作引物進行NASBA擴增，結果表明（圖2），當RNA稀釋至10-5（即550 fg/μL）時，檢測不到信號，因此該方法檢測的靈敏度可達10-4，即5.5 pg/μL總RNA。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌靈敏度試驗NASBA擴增結果Fig.2 The sensitivity test of Salmonella

2.3 人工污染樣品的檢測

以增菌后的9份人工污染樣品RNA、陽性質控鼠傷寒沙門氏菌標準菌株RNA和陰性質控無菌水作為模板，SM-F/SM-R作為引物進行NASBA檢測沙門氏菌的驗證試驗，結果見圖3。結果顯示，陽性質控出現約277 bp的明亮條帶，陰性質控無條帶，添加鼠傷寒沙門氏菌的4號、6～10號樣品和添加甲型副傷寒沙門氏菌的1、5、7、8號樣品均出現明亮的特異性條帶，大小約為277 bp，其余2種樣品RNA未出現擴增信號，結果與樣品實際添加情況相符。

圖3 沙門氏菌人工污染樣品NASBA擴增結果Fig.3 Results for detecting Salmonella in artificially contaminated samples by NASBA

3 結論與討論

本研究建立了食品中沙門氏菌的NASBA檢測方法，進行了方法的特異性和靈敏度試驗，同時驗證了對樣品檢測的實際應用效果。結果表明：應用NASBA技術檢測沙門氏菌特異性強，能夠從背景復雜的樣品中檢測出目標菌，試驗中無假陽性和假陰性結果；靈敏度高，對目標菌的檢出限達到10-4，即pg/μL級總RNA；檢測周期短，除增菌步驟外，只需要3 h～4 h即可得到結果，完成樣品中目標菌的篩選。

需要注意的是，食品一般要經過加工、深加工、冷凍/冷藏、包裝等步驟，在此過程中微生物很可能受到損傷，因此有必要先復蘇樣品中的受損菌，如果不經過增菌直接進行NASBA檢測，則極有可能造成漏檢。本研究建立的方法可大大縮短檢測時間，雖然為保證樣品的檢出率和準確性，需要進行增菌復蘇，但仍可將接收樣品至出具報告整個流程縮短至最短24 h。NASBA檢測的陽性結果仍需經生化確認。

另外，本研究為了更適用于基層檢驗機構和現場快速檢測，對于NASBA產物采用了最直觀、最簡便的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，但這種方法只能對目標菌定性。如果需要進行定量研究，應考慮基于電化學發光原理的NASBA-ECL檢測法、分子信標與NASBA結合的AmpliDet RNA技術以及原位NASBA（IS-NASBA）技術[14]。

[1]衛生部辦公廳.衛生部辦公廳關于2012年全國食物中毒事件情況的通報[EB/OL].中華人民共和國國家衛生和 計劃生育委員會官方網站,(http：//www.moh.gov.cn/mohwsyjbgs/s7860/201303/b70872682e614e4189d0631ae5527625.shtml),2013-02-26

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