固相萃取-HPLC法測定水樣中雌激素殘留

李龍飛，金瑩，趙曉磊，何金興，*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353；2.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266555）

雌激素是一類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)，可直接影響動(dòng)物代謝與繁殖的類固醇激素[1]。己烷雌酚（HEX）、己烯雌酚（DES）和雙烯雌酚（DE）是人工合成的雌激素，主要應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[2]，對動(dòng)物的生長催肥具有顯著作用。但雌激素可對人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾，并具有潛在的致癌性[3-5]。鑒于此美國、歐盟等多國已明文規(guī)定對其禁用或限用，我國也在2002年明確規(guī)定對其禁用[6]。飲水是雌激素進(jìn)入生物體的重要途徑之一，我國水污染現(xiàn)狀嚴(yán)重，已有證據(jù)表明部分地區(qū)日常飲水中存在雌激素[7]，雖然濃度很低，但由于雌激素類物質(zhì)即使在極低濃度下也會(huì)對生物體產(chǎn)生很大的影響[8]，所以為保障飲用水安全，對其進(jìn)行相應(yīng)檢測十分必要。

目前，測定環(huán)境中雌激素殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、免疫酶分析法[11]、毛細(xì)管電色譜法[12]、電化學(xué)分析法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[14]及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[15]等。然而，上述方法一般需要使用昂貴的儀器設(shè)備或進(jìn)行繁瑣的樣品衍生化等前處理步驟，才能檢測環(huán)境中低濃度殘留的雌激素，不適于日常樣品的檢測。與普通吸附材料多為物理吸附不同，本研究以溶膠凝膠技術(shù)合成的聚合物為固相萃取材料[16]，利用其具有選擇性吸附的特點(diǎn)，結(jié)合高效液相色譜進(jìn)行分析，建立了固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用檢測飲用水中3 種雌激素殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT 高效液相色譜儀，SPD-M20A 二極管陣列檢測器：日本島津公司；梅特勒AL104 電子天平：中國梅特勒-托利多公司；Supelco 固相萃取裝置：美國Supelco 公司；JB-2A 恒溫磁力攪拌器：上海雷磁創(chuàng)意儀器儀表有限責(zé)任公司。

己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚：色譜純，sigma 公司；乙腈、甲醇：色譜純，天津化學(xué)試劑廠；二次去離子水（DDW，18 MΩ cm-1，Milli-Q 超純水器制得）；四乙氧基硅烷（分析純，tetraethoxysilane，TEOS）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（分析純，3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、醋酸、磷酸：分析純，武漢大學(xué)化工廠。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取DES、DS、HEX 各2 mg，分別置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取3 種雌激素標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，配置成500 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，同樣于4 ℃條件下儲(chǔ)存。工作溶液則按需要用甲醇逐級稀釋。

礦泉水：于山東濟(jì)南長清地區(qū)超市購得；自來水：于山東濟(jì)南長清地區(qū)采得。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱Xterra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters，USA），流動(dòng)相為20 mmol/L H3PO4/甲醇，流速為1.0 mL/min，柱溫為38 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為230 nm。采用色譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將3 種樣品混合標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為10、8、5、2、1、0.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列，依次進(jìn)樣分析，然后根據(jù)峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 固相萃取柱的制備

在50 mL 具塞的圓底燒瓶中加入5 mL 乙腈，1 mL APTES，磁力攪拌30 min 后加入2 mL TEOS，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20 min，然后加入1 mL 0.01 mol/L 的醋酸，磁力攪拌10 min，置于水浴鍋中60 ℃孵化10 h，過濾，用甲醇洗滌，于真空干燥箱中100 ℃下老化10 h。將所得材料研磨成小顆粒，稱取200 mg，作為預(yù)富集柱的填料，使用前依次用3 mL 純水，3 mL 甲醇和3 mL 純水進(jìn)行活化處理。

1.2.4 樣品制備

試驗(yàn)選用礦泉水和自來水作為樣品，經(jīng)0.45 μm 水系濾膜過濾，于4 ℃條件下保存。使用時(shí)先用0.1 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)整pH，然后經(jīng)固相萃取柱富集，富集體積100 mL，用適當(dāng)?shù)南疵撘合疵摚瑢⑾疵撘河玫獨(dú)獯蹈桑⒂? mL 甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系濾膜過濾，注入HPLC 檢測分析。

制備加標(biāo)樣品。取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入礦泉水與自來水樣品中，分別配制成質(zhì)量濃度為50、100、150 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液，檢測過程與上述樣品相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

以20 mmol/L H3PO4/甲醇作為流動(dòng)相，研究不同比例對3 種雌激素分離效果的影響。

圖1 3 種雌激素混合色譜圖Fig.1 Chromatograph of estrogen mixed standard solution

從圖1 可以看出，20 mmol/L H3PO4/甲醇比例為36 ∶64（體積比）時(shí)，3 種雌激素在17 min 內(nèi)可以達(dá)到完全的基線分離，且各色譜峰具有良好的對稱性。根據(jù)單標(biāo)色譜圖的結(jié)果可知圖1 中依次出現(xiàn)的3 種雌激素分別是DES、DS、HEX。

2.2 固相萃取條件的選擇

將200 mg 合成聚合物裝填在預(yù)富集柱中，富集水溶液中的雌激素殘留，為達(dá)到最佳的萃取效果，分別對洗脫溶劑、樣品溶液pH、富集流速和洗脫流速等條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 洗脫溶劑的選擇

選擇濃度為100 μg/L 的混合樣品溶液進(jìn)行上樣，富集體積為100 mL，富集流速為1 mL/min，洗脫流速為1 mL/min，然后分別用3 mL 甲醇、乙腈進(jìn)行洗脫，按1.2.4 方法處理后進(jìn)行HPLC 分析，記錄出峰面積。不同的洗脫溶劑對三種雌激素的洗脫效果如圖2 所示。

圖2 不同洗脫劑對3 種雌激素洗脫效果圖Fig.2 Effect of different elution on extraction efficiency

從圖2 中可以看出當(dāng)以甲醇、乙腈作為洗脫劑時(shí)，乙腈對三種雌激素的洗脫效果除己烷雌酚外，其余兩種雌激素的峰面積均較低，同時(shí)可以看出甲醇的洗脫效果整體明顯優(yōu)于乙腈，所以最終選擇甲醇作為洗脫劑。

2.2.2 pH 對萃取效果的影響

分別配制濃度為100 μg/L，pH 為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的雌激素水溶液100 mL，控制流速為1 mL/min進(jìn)行富集，然后用3 mL 甲醇洗脫，洗脫流速為1 mL/min，按1.2.4 方法處理后進(jìn)行HPLC 分析，記錄出峰面積，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH 對雌激素富集效果的影響曲線Fig.3 Effect of pH on extraction efficiency

由圖3 可見，pH 在4.0～8.0 范圍內(nèi)，3 種雌激素的峰面積變化不大。DS，HEX 在pH 低于6.0 時(shí)，峰面積均隨pH 的增加而增大，當(dāng)pH 超過6.0 時(shí)，峰面積略有下降；而DES 在pH 超過7.0 時(shí)開始下降，但鑒于DES 在pH 6.0 與pH7.0 時(shí)的峰面積相差不大，最終選擇基質(zhì)pH 為6.0 用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2.3 富集流速對萃取效果的影響

用100 μg/L 的雌激素水溶液上樣100 mL，以考察富集流速對3 種雌激素吸附效果的影響。從圖4 可以看出，富集流速在0.5 mL/min 到2.0 mL/min 范圍內(nèi)，3種雌激素的色譜峰面積一直呈下降趨勢，但過慢的富集流速勢必會(huì)影響到整個(gè)富集分析過程的效率，綜合考慮，最終選擇1 mL/min 作為適當(dāng)?shù)母患魉佟?/p>

圖4 富集流速對雌激素富集效果的影響曲線Fig.4 Effect of enrichment flow rate on extraction efficiency

2.2.4 洗脫流速對萃取效果的影響

與富集流速相同，洗脫流速也是影響分析效率的重要參數(shù)，以1.0 mL/min 的流速上樣吸附后用甲醇洗脫，洗脫流速分別控制為0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min，測定結(jié)果如圖5 所示。

圖5 洗脫流速對雌激素分離效果的影響曲線Fig.5 Effect of elution flow rate on the desorption of estrogen

可以看出，洗脫流速在0.5 mL/min 和1.0 mL/min時(shí)對3 種雌激素的解吸效果相差不大，進(jìn)一步提高洗脫流速則解吸效果開始明顯下降，可能的原因是過快的洗脫流速致使洗脫液無法與被萃取物充分作用，考慮到純化效率，洗脫流速最終選定為1.0 mL/min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢測限

以雌激素質(zhì)量濃度X（μg/mL）與相應(yīng)的目標(biāo)組分的峰面積Y（S）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，3 種雌激素對應(yīng)的線性方程及相關(guān)系數(shù)如表1 所示。

表1 3 種雌激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與相關(guān)系數(shù)（R2）Table 1 Standard curve and relevant coefficient of three estrogens

從表1 中可以看出，各標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，說明3 種雌激素的線性關(guān)系良好。

逐步選擇較低及較高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)樣分析，測得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出線性范圍。由此測得DES 的線性范圍是0.05 mg/L～500 mg/L，DS 的線性范圍是0.05 mg/L～500 mg/L，HEX 的線性范圍是0.1 mg/L～500 mg/L；根據(jù)3 倍噪音的峰面積響應(yīng)值求出最低檢出限（LOD），其DES、DS、HEX 的最低檢出限分別為0.10，0.18 和0.29 μg/L。

2.4 加標(biāo)回收率及重復(fù)性

用礦泉水與自來水分別配制3 個(gè)濃度水平的雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中每個(gè)濃度水平重復(fù)測定5次，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～7.8%（n=5），其結(jié)果見表2，表3。

表2 礦泉水中雌激素加標(biāo)的重復(fù)性測定情況Table 2 The extraction peak areas and RSD of estrogen in mineral sample

表3 自來水中雌激素加標(biāo)的重復(fù)性測定Table 3 The extraction peak areas and RSD of estrogen in tapwater sample

由此可知，該方法具有較好的重現(xiàn)性。經(jīng)HPLC分析，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品加標(biāo)回收率（見表4）。

由表4 可以看出，3 種雌激素的加標(biāo)回收率為70.4%～80.1%，可滿足水樣中雌激素殘留的痕量檢測需要。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式如下：

表4 不同樣品添加濃度對應(yīng)雌激素的回收率Table 4 The recoveries of estrogen on three different spiked concentrations

2.5 實(shí)際樣品的測定

在優(yōu)化的條件下，對市售礦泉水及自來水樣品進(jìn)行檢測，其中己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚均未檢出。樣品色譜及其加標(biāo)色譜如圖6、圖7 所示。

圖6 礦泉水樣品色譜圖Fig.6 Chromatograph of a blank mineral sample and mineral sample spiked with 50 μg/L

圖7 自來水樣品色譜圖Fig.7 Chromatograph of a blank tap-water sample and tap-water sample spiked with 50 μg/L

3 結(jié)論

普通固相萃取材料的吸附性質(zhì)多為物理吸附，雖具有一定的富集與凈化效果，但相對選擇性較差。本研究以溶膠凝膠技術(shù)合成的聚合物為固相萃取填充材料，其功能單體與雌激素間被認(rèn)為可通過氫鍵相互作用，從而以非共價(jià)鍵連接，具有選擇性吸附的特點(diǎn)。該法前處理操作簡便快捷，結(jié)合高效液相色譜，建立了同時(shí)測定日常飲水中3 種雌激素殘留的檢測方法。在優(yōu)化的條件下，3 種雌激素的最低檢測限為0.1 μg/L～0.29 μg/L，加標(biāo)回收率為70.4 %～80.1 %，且RSD 為3.5%～7.8%，可滿足定量分析的需要，方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于該類激素的殘留監(jiān)控。

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