糖水水果罐頭中主要腐敗微生物的分離純化及鑒定研究

許美玲，張鑫，楊娟，陳偉，杜震，董麗君，張麗，周洪娟，郝建光

（臨沂出入境檢驗檢疫局，山東臨沂276034）

罐頭是我國具有傳統特色的產業，是我國主要的加工食品，在出口食品中占有重要地位。其中，水果罐頭是國內外罐頭食品市場頗受歡迎的產品，約占罐頭總產量的25%，具有較大的發展前景[1-2]。糖水水果罐頭雖然經過殺菌處理，但有時在罐頭食品中仍然可能有微生物存在，導致水果罐頭中果肉發生腐敗變質。對由于不同罐頭制品營養環境各不相同，其污染菌也不盡相同，在實際檢測中常常采取不同性質的培養基利于檢出特定的污染菌[3]。為防止水果罐頭腐敗變質，延長貨架期，保護我國消費者健康安全及出口食品安全，本文旨在對糖水水果罐頭中的污染微生物進行分析，探索糖水水果罐頭中微生物檢測方法，降低微生物污染率。同時，也為罐頭食品微生物檢測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

草莓罐頭、黃桃罐頭：來源于工廠發生腐敗變質的罐頭，罐內果肉組織解體。

1.1.2 培養基

1）硫乙醇酸鹽液體培養基（FT）、錳鹽營養瓊脂、酸性肉湯、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、皰肉培養基基礎、麥芽浸膏湯均購自北京陸橋技術有限責任公司。

2）嗜熱耐酸芽孢桿菌培養基：酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀4 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高壓滅菌。

3）AC 瓊脂：酵母浸膏3g，蛋白胨20g，牛肉膏3g，麥芽浸膏3 g，葡萄糖5 g，VC0.2 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高壓滅菌。

4）硫乙醇鈉瓊脂培養基：按每100 mL 硫乙醇胺肉湯加入1.5%～2.0%瓊脂粉，121℃，15 min 高壓滅菌。

1.1.3 試劑

細菌瓊脂粉、葡萄糖、胰酪蛋白胨、麥芽浸粉、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨均購自北京陸橋生物技術有限公司；磷酸氫二鉀、氯化錳均為分析純；BD生化鑒定板條購自美國BD 生物技術有限公司。

1.1.4 儀器

MOS-3020 SNAYO 高壓滅菌鍋、MIR-253 生化培養箱：日本三洋電子有限公司；BUG BOX M 厭氧微生物培養工作站：英國RUSKINN 公司；CLASSⅡTYPE A2 生物安全柜：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；PHOENIX 100 微生物鑒定儀：美國BD 設備有限公司；BX41 OLYMPUS 生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方式

采用35、55 ℃兩種溫度；有氧與厭氧環境。

1.2.2 密封性檢驗

將罐頭制品放入水中，觀察有無氣泡產生[4]。

1.2.3 內容物增菌

將待測樣品放置在超凈工作臺上，開啟紫外燈30 min后，用75%酒精進行表面消毒。用滅菌開罐器開啟罐頂，如系胖聽罐頭可用注射器吸取少許罐頭內氣體用以鑒定氣體種類。無菌取出罐頭樣品至均質袋內均質，分別取1 mL 內容物轉入皰肉肉湯、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、麥芽浸膏肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯、酸性肉湯增菌培養基中，分別在35、55 ℃兩種溫度下連續培養96 h，每24 小時觀察記錄一次。

1.2.4 分離培養

分別選用皰肉瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養基、嗜熱耐酸芽孢桿菌培養基、AC 瓊脂培養基、麥芽浸膏瓊脂培養基進行分離培養。連續培養120 h，每24 小時觀察記錄試驗現象。

1.2.5 純培養

將各培養基中培養物挑取單菌落分別接種到與其相對應的培養基中，進行純培養。

1.2.6 厭氧培養和高溫驗證試驗

將有氧分離的純培養物接種到皰肉瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養基、嗜熱耐酸芽孢桿菌培養基、AC 瓊脂培養基、麥芽浸膏瓊脂培養基，分別置于厭氧微生物工作站中，在35、55 ℃以及有氧環境55 ℃條件下培養。55 ℃條件下培養的培養基在培養96 h 后放入35 ℃條件下繼續培養48 h，觀察并記錄實驗現象。

1.2.7 鑒定方法

采取革蘭氏染色、芽孢染色[5]等染色方法相結合的方式對試驗中的微生物進行鑒定，根據其生長特征、生理特征、外觀形態并結合細菌鑒定手冊[6]、伯杰細菌鑒定手冊[7]進行進一步判斷，最后利用微生物鑒定儀進行菌種綜合鑒定。

2 結果與討論

2.1 罐頭密封性檢測結果

實驗所用罐頭密封性良好，放入水中并未產生氣泡。草莓罐頭內容物的pH 經測定為2.88，黃桃罐頭內容物的pH 為3.46，同批次正常草莓罐頭和黃桃罐頭的pH 范圍分別為3.4～3.6 和3.6～4.0，草莓罐頭發生了酸化，pH 降低，而黃桃罐頭pH 在正常范圍內。因pH小于4.6，屬于酸性罐頭。本次實驗所選用的兩種糖水水果罐頭均未發現胖聽現象。

2.2 罐頭中腐敗微生物增菌結果及分析

不同增菌液的增菌效果見表1。

表1 黃桃罐頭、草莓罐頭中腐敗微生物增菌實驗結果Table 1 Choice of optical medium for enriching spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

由表1 可以看出，在培養24h 內未發現菌落生長現象，培養48 h 后培養基出現不同程度的渾濁現象，溴甲酚紫葡萄糖肉湯紫色褪去，皰肉肉湯中出現產酸產氣現象。黃桃罐頭在35 ℃條件下，在硫乙醇酸鈉肉湯中培養效果最好，在溴甲酚紫葡萄糖肉湯中未見生長，在55 ℃培養條件下，未見生長。草莓罐頭在35 ℃條件下，在酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯中培養效果最好，在55 ℃條件下，在溴甲酚紫葡萄糖肉湯、麥芽浸膏肉湯中培養效果最好，在兩種溫度下，酸性肉湯中未見生長。

2.3 罐頭中腐敗微生物分離、純化與培養

2.3.1 罐頭中腐敗微生物分離培養結果與分析

腐敗微生物分培養結果見表2。

在進行分離培養時，黃桃罐頭在皰肉瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基和硫乙醇酸鈉瓊脂培養基上培養效果最好，草莓罐頭在皰肉瓊脂培養基、AC 瓊脂培養基和嗜熱耐酸芽孢桿菌培養基上分離培養效果最好。所有培養基在24 h 內均為發現菌落生長，培養48 h 后培養效果漸佳。

2.3.2 罐頭中腐敗微生物純培養結果與分析

罐頭中腐敗微生物純培養結果見表3。

表2 罐頭中腐敗微生物培養基分離篩選結果Table 2 Growth status of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

表3 罐頭中腐敗微生物純培養結果Table 3 Growth status of pure culture of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

在皰肉瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養基上，分離得到的單菌落生長狀況最佳，在24 h 時即可達到較好的生長狀態。而其他幾種培養基也有生長，但生長緩慢。由此可以看出，皰肉瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養基是較好的純化培養基，其他培養基生長效果較差。

2.3.3 罐頭中腐敗微生物厭氧培養結果與分析

通過對純化的4 株菌株進行厭氧培養，48 h 時觀察結果發現，A 菌株在厭氧條件下不生長，B、C、D 菌株在厭氧條件下生長良好。

2.4 罐頭中腐敗微生物的鑒定

2.4.1 菌落形態特征和鏡檢結果

分離的腐敗微生物菌落形態及革蘭氏染色鏡檢結果見表4。

2.4.2 微生物鑒定儀鑒定結果

根據對分離純化菌株革蘭氏染色結果，選擇BD細菌的快速鑒定板條，系統給出的鑒定結果見表5。

表4 罐頭中污染菌形態觀察Table 4 Cell morphology of bacterium in canned peach and canned strawberry

表5 分離到的微生物鑒定結果Table 5 The identification results of the isolated micro-organism

3 結論

1）罐頭食品中的微生物受食品中的pH 的影響

罐頭食品按pH 的不同可分為低酸性食品和酸性食品，pH≥4.6 為低酸性食品，pH≤4.6 為酸性食品。糖水水果罐頭pH 在2.5～3.5 之間，故糖水水果罐頭為酸性食品。酸性罐頭食品能生長繁殖的耐酸的微生物無論在數量上還是在種類上都遠比低酸性罐頭食品少。微生物生長環境不同，分離得到的污染菌也不盡相同。因此，選擇合適的增菌肉湯及分離培養基尤其重要。通過糖水水果罐頭在不同增菌培養基及分離培養基分離結果，可以看出：黃桃罐頭硫乙醇酸鈉肉湯中增菌效果最好，在皰肉瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基和硫乙醇酸鈉瓊脂培養基上培養效果最好，這與史振霞等的研究結果類似[8]；草莓罐頭在酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯中增菌效果最佳，在皰肉瓊脂培養基、AC 瓊脂培養基和嗜熱耐酸芽孢桿菌培養基上分離培養效果最好。

2）通過生化實驗，結合細菌鑒定手冊、伯杰細菌鑒定手冊和BD 微生物鑒定儀，發現黃桃罐頭、草莓罐頭腐敗過程中滋生的主要微生物為：A 菌為成團泛菌（Pan.agglomerans）；B 和C 菌株為同一種菌，為地衣芽孢桿菌（Baci. licheniformis）；D 菌為蠟樣芽孢桿菌（Baci.cereus）。

[1] 任國平,張倩,范麗平,等.水果罐頭加工中生物危害的分析和控制[J].食品研究與開發,2011,32(9):210-212

[2] 杜紅利,劉暢.罐頭制品中微生物檢測方法[J].肉類工業,2008,11:40-42

[3] 閆訓友,杜洪利,張艷麗,等.山楂罐頭中腐敗微生物的分離鑒定及其特性的研究[J].食品工業科技,2010,31(5):191-194

[4] 馬長利,張志新,郝子成.熱解糖梭菌致蘑菇罐頭膨脹變質的實驗分析[J].中國食品衛生雜志,2005(5):433-435

[5] 羅雪云,劉宏道.食品衛生微生物檢測標準手冊[M].北京:中國標準出版社,1995:400-438

[6] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001

[7] R E 布坎南,N E 吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].8 版.北京:科學出版社,1984

[8] 史振霞,杜洪利,歐旭,等.桃罐頭中腐敗微生物的分離純化及鑒定研究[J].食品科學,2009,30(21):278-282