HPLC法同時檢測肉制品中9種防腐劑和甜味劑

關麗麗，夏文娟，盧志曉，高源，李彥，梁君妮，沙美蘭，牟妍，曹鵬，*

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000；2.張裕集團有限公司白蘭地分公司，山東煙臺264000；3.日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276826）

甜味劑和防腐劑作為一類重要的食品添加劑被廣泛用于食品生產加工，這類食品添加劑本身不能向人體提供營養物質。在我國食品衛生管理辦法中，目前國家批準使用的食品添加劑種類很多，其用量也有嚴格規定[1]，但是部分不法食品生產者經營者出于贏利等目的，在食品中超范圍或超限量使用食品添加劑。甜味劑（糖精鈉等）和防腐劑（山梨酸、苯甲酸等）在市場上已有濫用的趨勢，給食品安全帶來隱患，對消費者的健康造成直接的威脅[2]。對羥基苯甲酸酯類是新一代高效低毒消毒殺菌防腐劑，相比于苯甲酸和山梨酸及其鹽類，此類物質的抗菌能力強，應用的pH 范圍廣，用量低，并且使用安全，經濟方便，對人體刺激較小。但Roufledge 等[3]發現對羥基苯甲酸酯具有弱雌激素活性，這一發現對原有的對羥基苯甲酸酯低毒性的觀點提出了挑戰。歐盟明確規定：以對羥基苯甲酸計，食品中對羥基苯甲酸酯的最高允許含量為0.1%，當幾種對羥基苯甲酸酯復配使用時，其總量不得超過0.1%。

現用于檢測食品中添加劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-7]、高效液相色譜-質譜法[8]、氣相色譜法[9-13]及氣相色譜-質譜法[14]等。氣相色譜法存在樣品前處理步驟繁瑣、靈敏度不高的弱點，而現有的高效液相色譜法存在檢測種類少的問題。同時現有方法測定的基質多為飲料等[15]，對于豬肉及熏煮香腸中防腐劑和甜味劑的檢測卻鮮有報道，而且沒有山梨酸、苯甲酸等防腐劑同對羥基苯甲酸酯一起檢測的方法。因此本研究為提高工作效率，更好地適應食品檢測分析工作的需求和發展趨勢，采用高效液相色譜法同時測定了豬肉中及熏煮香腸中的9 種甜味劑和防腐劑，樣品前處理簡單，檢測結果準確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Aglient 1100 高效液相色譜儀配有二級管陣列檢測器（DAD）：美國安捷倫；Rios8 milli-QG 超純水儀：美國密理博；ZJ000832 電子天平（精確至0.01 g）：長沙湘平科技發展有限公司；VORTEX-2 GENIE 漩渦混合器：Scientific Industries；KQ-500E 超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；CF16RXⅡ離心機：日本HITACHI。

甲醇、乙腈HPLC 純（德國Merck），水為超純水，乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鉛、乙酸銨、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、草酸鉀和鎢酸鈉均為分析純。標準品：山梨酸、苯甲酸、糖精鈉（國家標準物質中心），對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、安賽蜜、脫氫醋酸純度均＞99.0%，購自Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理方法

稱取5.0 g 經均質處理的樣品于50 mL 比色管中，向比色管中加入30 mL 甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（1+1）、1 mL 1%三氯乙酸振蕩超聲30 min，漩渦振蕩5 min，然后用甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（1+1）定容至刻度，5 000 r/min 離心5 min。取上清液過0.2 μm 有機相濾膜，供HPLC 儀器分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：phenomenex Gemini C18（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；流動相：甲醇和0.02 mol/L 乙酸銨，梯度洗脫程序：0～5 min，10%～35%甲醇；5 min ～15 min，35%～74%甲醇；15 min ～20 min，74 %～90 %甲醇；20 min ～25 min，90 %～10 %甲醇。Agilent DAD 檢測器，檢測波長：230 nm 和254 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇

本研究比較了甲醇水（1 ∶1）溶液、甲醇磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）（1 ∶1）、乙腈水（1 ∶1）和乙腈磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）（1 ∶1）4 種提取液對9 種組分同時提取的提取效果，結果表明4 種提取液的提取效果均可達到檢測需要。其中乙腈水和乙腈磷酸鹽緩沖溶液凈化效果優于甲醇水溶液和甲醇磷酸鹽緩沖溶液，但是乙腈水和乙腈磷酸鹽緩沖溶液提取會導致安賽蜜和糖精鈉出現前展峰，通過調節流動相比例及pH 峰型仍無明顯改善，且乙腈較甲醇毒性大、成本高，因此綜合考慮后不選擇含乙腈的提取液。同時發現甲醇磷酸鹽緩沖溶液回收率高于甲醇水溶液，且相對凈化負擔小，因此本研究采用甲醇磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）（1 ∶1）作為提取液。四種提取液提取效率圖見圖1。

圖1 4 種提取液提取效率比較Fig.1 The comparison of extraction efficiency with different extraction solvents

2.2 沉淀劑的選擇

由于豬肉中及其熏煮香腸基質復雜，含有較多的蛋白質、脂肪等，因此需要選擇合適的沉淀劑進行進一步的凈化。食品添加劑檢測常用的沉淀劑有亞鐵氰化鉀-乙酸鋅；硫酸-鎢酸鈉；乙酸鉛、草酸鉀-磷酸氫二鉀等沉淀體系及三氯乙酸、冰醋酸等溶液，其中亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀體系通過絡合效應使蛋白質等物質沉淀，而后幾種沉淀劑均是通過使蛋白質變性達到凈化效果。本研究通過比較幾種沉淀劑在豬肉中及其熏煮香腸基質的凈化效果，發現亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀體系和三氯乙酸的凈化效果較其它幾種好，但是亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀體系由于沉淀能力過強，會使山梨酸和苯甲酸回收率降低約10%，而1%三氯乙酸沉淀效果好且回收穩定，因此本研究采用1%三氯乙酸作為沉淀劑。

2.3 檢測波長的確定

安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類化合物因其結構不同，在紫外區的特定吸收波長也不同，本研究用標準溶液在190 nm～800 nm波長下進行3D 光譜掃描，發現各自的最大吸收波長分別為安賽蜜226 nm、苯甲酸224 nm、山梨酸254 nm、糖精鈉202 nm、脫氫乙酸230 nm、對羥基苯甲酸酯類化合物254 nm，與已有文獻報道一致[1-12]。其中安賽蜜、苯甲酸、脫氫乙酸在230 nm 處有較高的靈敏度，而對羥基苯甲酸酯類化合物、山梨酸在254 nm 處紫外吸收較高，在230 nm 處吸收偏低，綜合考慮9 種物質的靈敏度，本研究最終選擇在230 nm 和254 nm 兩種波長下同時檢測9 種添加劑，標準品液相色譜圖見圖2。

圖2 標準品液相色譜Fig.2 Chromatogram of standard solution

2.4 線性范圍、標準曲線方程及定量限

在實驗條件下，以峰面積Y 為縱坐標，質量濃度X（mg/L）為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程，以基線噪聲10 倍峰面積對應的各組分質量濃度為定量限（S/N=10），7 種防腐劑和2 種甜味劑標準曲線方程、線性范圍和定量限見表1。

表1 9 種目標物的標準曲線方程、線性范圍、相關系數和定量限Table 1 Standard curve equations，linear ranges，correlation coefficients and limits of quantification of 9 target analytes

2.5 方法回收率及精密度

在不同的熏煮香腸和豬肉樣品中添加文中所測防腐劑和甜味劑，分別添加3 個不同濃度水平的混合標準溶液，每個水平重復測定6 次，采用外標法進行定量，計算回收率和精密度。試驗結果表明本方法9 種防腐劑和甜味劑的回收范圍85.25%～98.26%，RSD 值為1.26%～5.39%（詳見表2），表明本方法有良好的精密度和準確度，滿足分析要求。

表2 樣品中9 種目標物的回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 9 target analytes spiked in the sample（n=6）

續表2 樣品中9 種目標物的回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 9 target analytes spiked in the sample（n=6）

圖3 檢出山梨酸的火腿腸色譜圖Fig.3 Chromatogram of ham containing sorbic acid

2.6 實際樣品測定

采用本方法對市售7 種熏煮香腸和3 種豬肉進行檢測，所測7 種熏煮香腸中均檢出山梨酸，其中一種火腿腸所測山梨酸含量為70 mg/kg（色譜圖見圖3），豬肉中均未檢出文中所測防腐劑和甜味劑。國家規定肉類制品中山梨酸的限量為0.075 g/kg，熏煮香腸中山梨酸的限量為1.5 g/kg，因此所測熏煮香腸符合國家標準要求。

3 結論

本研究建立了測定豬肉及熏煮香腸中7 種防腐劑和2 種甜味劑的高效液相色譜法，樣品經甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（1+1）、1 mL 1%三氯乙酸振蕩超聲、漩渦振蕩提取，phenomenex Gemini C18 色譜柱分離后于230 和254 nm 下定性、定量分析，外標法定量。該方法靈敏度高、操作簡單高效，適用于豬肉及熏煮香腸中7種防腐劑和2 種甜味劑定性、定量分析。

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