銀杏葉提取物對氧糖剝奪誘導的體外培養大鼠星形膠質細胞損傷的影響*

牟芳芳 于永娟 張澤安 陸萍萍 邵水金

（上海中醫藥大學，上海 201203）

銀杏葉提取物（EGb761）含有多種活性成分，具有清除自由基和過氧化脂質、擴張血管、改善循環、抗動脈粥樣硬化以及神經保護等作用，廣泛應用于治療心腦血管系統疾病，對腦缺血缺氧損傷有保護作用［1-2］，但機理尚不完全清楚。星形膠質細胞是中樞神經系統主要組成細胞，負擔了主要的細胞間物質和信號交流功能［3-4］。本研究采用體外原代培養的大鼠皮層星形膠質細胞，通過氧糖剝奪再復氧建立細胞損傷的模型，探討EGb761對抗缺氧再復氧誘導星形膠質細胞損傷作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 金納多注射液（17.5 mg/5 mL），臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司，DMEM、無糖DMEM、0.25%胰蛋白、D-Hanks液等購于Gibco公司，胎牛血清（Hy-Clone），多聚賴氨酸（Sigma），連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）購于上海國藥集團化學試劑有限公司，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，Bradford試劑盒、Western blot配膠試劑盒、PVDF 膜、WST-1、bcl-2、bax、caspase-3 抗體、二抗及ECL顯色試劑盒等皆購于碧云天生物技術有限公司。

1.2方 法

1.2.1 星形膠質細胞原代培養 將出生24 h內的SD乳鼠處死后置75%酒精中浸泡5 min，取出帶入無菌室，用消毒的手術器械取出腦組織，置于裝有預冷DHanks液的無菌玻璃皿中，清洗3次，在解剖鏡下用顯微鑷剝離腦膜，取出皮質，置于裝有D-Hanks液的無菌小瓶中剪碎，棄去D-Hanks液，再用D-Hanks液輕柔吹打組織塊2次后，將組織碎塊轉入0.25%的胰蛋白酶液的離心管內，放入37℃，5%CO2培養箱中30min，其間震蕩1～2次。加入完全培養基 （20%FBS＋DMEM高糖＋100 U雙抗）以終止消化，靜置2 min后，用吸管吹打數次，形成初細胞懸液。經200目篩網過濾后加入培養瓶。置于培養箱30 min后，倒轉培養瓶，吸出液體，利用差速黏附法去除成纖維細胞，進行細胞計數后，以1×106/mL的密度種入事先包被多聚賴氨酸的培養瓶中，置 37℃的 5%CO2培養箱中，2～3 d換液 1次，培養7～9 d后傳代使用。細胞進行GFAP免疫熒光+Hoechst 33258復染法鑒定，第3代星形膠質細胞純度>95%。

1.2.2 氧糖剝奪/復氧 （oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型建立及實驗分組［5-6］在細胞約80%融合時，進行OGD/R實驗。取棄去原培養液，用無糖DMEM輕洗1遍，加入終濃度為10 mmol/L的Na2S2O4無糖DMEM液，置于37℃，5%CO2孵箱中孵育90 min［以上為氧糖剝奪（OGD）］。取出培養板，棄去原液，加入正常培養液，放入37°C，5%CO2孵箱中孵育24 h［以上為復氧處理（R）］。實驗分為3組。正常對照組：不經OGD/R，始終給予正常培養液。模型組：OGD 90 min，復氧24 h處理。EGb761組：EGb761終質量濃度分別為 25、50、100 μg/mL，于 OGD 前 1 h 加入，直至OGD/R實驗結束。

1.2.3 細胞活力測定（WST-1法） 按WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書進行操作，96孔板每孔加入100 μL細胞懸液，使細胞數量為每孔6000個，培養24 h。各實驗組進行OGD 90 min，復氧24 h后，每孔加入WST-1溶液10 μL。以加入相應量細胞培養液和WST-1溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照，每組5復孔，培養箱內繼續孵育2 h。孵育結束后在全自動酶標儀上測定450 nm處的光密度值（OD），參考波長為620 nm。

1.2.4 培養液中LDH測定 乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）是一種廣泛存在于所有細胞胞漿中的酶，此酶可因細胞受損后細胞膜通透性改變而大量滲漏至胞外，通過測定培養液中該酶的活力可間接判斷細胞的受損程度。OGD結束后，不經再給氧處理，從培養板各孔取上清，按乳酸脫氫酶測定試劑盒說明書操作，在酶標儀450 nm波長下讀取各孔OD值，計算各樣本的平均值。LDH含量以U/L表示。

1.2.5 Hoechst 33258染色96孔板內，每孔加入6×104/mL細胞懸液100μL培養24h。各實驗組進行OGD 90 min，復氧24 h后，吸盡培養液，每孔加入100 μL固定液，固定20 min，棄去固定液，0.01 mol/L的PBS洗兩遍，每次2 min，吸盡液體。加入100 μL Hoechst 33258染色液，染色5min。棄去染色液，PBS洗兩遍，每次2 min。直接在熒光顯微鏡檢測，可見被染成藍色的細胞核，其中活細胞核呈彌散均勻藍色熒光，出現細胞凋亡時，染色質固縮，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。

1.2.6 細胞免疫熒光染色 將經過OGD/R以及EGb761孵育后的各組細胞，用4%多聚甲醛固定20min，PBS浸洗細胞3次，每次2 min，加入1%的BSA，37℃條件下孵育30min后，室溫放置1 h，棄去BSA，加入GFAP 抗體（1∶100），對照組加入等量 PBS，4 ℃過夜。然后37℃條件下孵育2 h，PBS浸洗細胞3次，每次2 min，加入二抗，37℃條件下孵育1 h。經Hoechst 33258染核5 min后，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.2.7 Western blot檢測 blc-2、bax、caspase-3 蛋白表達變化 經過OGD/R以及EGb761孵育后的六孔板上的各組細胞，每孔加入裂解液100 μL，經裂解、破碎、離心后，用Bradford法進行蛋白定量，調整各樣品蛋白終濃度為 2 μg/μL。 取 20 μL 樣品進行電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加相應的一抗，4 ℃冰箱過夜：blc-2 （1∶1000）、bax （1∶500）、caspase-3（1∶500）、β-actin（1∶1000）。滴加相應二抗（1∶1000），室溫孵育 2 h，PBS 清洗，加入 ECL，反應 1～5 min，使用Tanon 4500SF全自動數碼凝膠化學發光圖像分析系統和GIS 1D分析軟件檢測蛋白表達，與內參相比，進行組間統計分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。各組數據以表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同質量濃度EGb761對OGD/R誘導星形膠質細胞活力及LDH釋放量的影響 生長狀態良好的星形膠質細胞經過不同質量濃度EGb761孵育24 h后，WST-1測定細胞活性。結果顯示（見圖1）：當EGb761質量濃度低于50 μg/mL時，藥物對細胞沒有毒性作用，且對細胞具有一定的刺激增殖作用。當藥物質量濃度大于100 μg/mL后，細胞活力隨藥物質量濃度的增高而逐漸降低。星形膠質細胞與EGb761共培養24 h后，進行OGD處理。LDH活性檢測結果顯示（見圖2）：星形膠質細胞經OGD處理后LDH的釋放與對照組比較明顯升高（P＜0.01），與 EGb761（25、50、100 μg/mL）共培養24 h，能使LDH的釋放量降低，與OGD組相比差異明顯（P ＜0.01），而高質量濃度組（100 μg/mL）與低質量濃度組（25、50 μg/mL）相比，其 LDH 釋放量又有增高的趨勢。其結果提示：EGb761在一定質量濃度范圍內能減輕OGD誘導的星形膠質細胞損傷。

圖1 不同質量濃度EGb761孵育24 h對大鼠皮層星形膠質細胞活力的影響

圖2 EGb761對星形膠質細胞OGD損傷LDH釋放量的影響

為了觀察EGb761與OGD/R（90 min/24 h）損傷對星形膠質細胞活性的影響，筆者用WST-1法進行檢測，結果顯示（見圖3）：相較于正常對照組，經OGD/R處理后的皮層星形膠質細胞的OD值明顯降低 （P＜0.01）。 而 EGb761 組（25、50 μg/mL） OD 值顯著升高（P＜0.01），且高低劑量組間相比差異明顯（P＜0.05）。其結果表示，EGb761能夠減輕OGD/R導致的細胞損傷，提高細胞活性。

圖3 EGb761對星形膠質細胞OGD/R損傷后細胞活性的影響

2.2 EGb761對星形膠質細胞OGD/R損傷后細胞形態的影響 （免疫熒光染色） GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein）是一種星形膠質細胞特異性的中間纖維蛋白，是星形膠質細胞的骨架蛋白。GFAP染色后，在熒光顯微鏡下觀察（見圖4）：模型組星形膠質細胞數量明顯減少，細胞突起收縮、變少，相互之間的交聯減少；EGb761組與模型組相比細胞數量增多，與正常對照組相比細胞形態變化較少，仍有較多突起，相互交聯。這表明，EGb761在形態上對星形膠質細胞具有保護作用。

圖4 EGb761對星形膠質細胞OGD/R損傷后形態變化

2.3 EGb761對OGD/R誘導大鼠皮層星形膠質細胞凋亡的影響 各組細胞進行Hoechst 33258染色。熒光顯微鏡下可見正常細胞核呈彌散均勻藍色熒光，出現細胞凋亡時，染色質固縮，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。模型組凋亡星形膠質細胞所占百分比明顯增高，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；EGb761干預后凋亡細胞明顯減少（P＜0.01）；且高低劑量組之間亦有明顯差異（P＜0.01）（見圖 5）。

2.4 EGb761對OGD/R誘導星形膠質細胞損傷bcl-2、bax、caspase-3表達的影響 各組細胞用Westernblot法檢測 bcl-2、bax、caspase-3蛋白。 細胞經 OGD/R損傷后，促凋亡基因bax蛋白表達增高，而EGb761能下調bax蛋白表達。相對bax表達變化，bcl-2變化較不明顯（圖6A）。一般認為bcl-2與bax形成異源二聚體調節細胞凋亡，而bcl-2/bax比值對決定細胞命運起關鍵作用，從圖6B來看，OGD/R損傷使bcl-2/bax比值顯著降低（P＜0.01），而給予EGb761發現bcl-2/bax比值明顯升高（P＜0.01）。

同時，caspase-3作為凋亡程序啟動的重要蛋白分子，如圖6C所示，OGD/R誘導可使caspase-3激活，表達量比正常對照組增加約2.5倍 （P＜0.01），而給予EGb761則明顯抑制了OGD/R導致的細胞caspase-3激活，與OGD/R相比有統計學意義（P＜0.01）。由此推測EGb761對大鼠皮層星形膠質細胞的保護作用可能通過調整bcl-2、bax蛋白表達，增加bcl-2/bax比值，抑制caspase-3激活，從而抑制細胞凋亡。

圖5 EGb761對OGD/R誘導大鼠皮層星形膠質細胞凋亡的影響

圖6 EGb761對星形膠質細胞OGD/R損傷后bcl-2、bax、caspase-3表達變化的影響

3 討 論

多數缺血性腦血管病變的主要病理過程為腦缺血再灌注，在缺血中心區以細胞壞死為主，而在缺血邊緣區（半暗帶）尚存部分葡萄糖和氧，以細胞凋亡為主，半暗帶發展趨勢可能最終影響腦梗死體積［7］。研究證實EGb761能通過抑制炎癥反應、清除氧自由基、抑制性氨基酸之間的動態平衡、抑制細胞凋亡等途徑保護腦血管、減輕缺血性腦損傷［8］。在筆者前期試驗中也已證實EGb761給藥能減輕大腦中動脈缺血再灌注（MCAO）大鼠行為障礙，明顯減少腦梗死體積，抑制MCAO大鼠海馬caspase-3的表達，而TUNEL檢測也表明，在缺血半暗帶區凋亡的神經細胞數顯著下降，證明了EGb76l通過抑制細胞的凋亡而發揮其神經保護作用［4］。

星形膠質細胞是哺乳動物腦內分布最廣泛的一類細胞，其量遠超過神經元，在中樞神經系統中神經元不可能離開星形膠質細胞而存在，因此不能脫離星形膠質細胞研究神經損傷的機制。有學者研究發現星形膠質細胞在腦損傷后的信號傳遞等十分重要的作用，其凋亡可以促成神經元的繼發性死亡，從而導致梗死區的進一步擴大［9-10］。因此有效預防腦缺血后星形膠質細胞凋亡的發生，將很大程度上起到直接和間接的腦保護作用。

在以往的實驗也發現EGb761能抑制MCAO大鼠腦皮質Cx43的磷酸化［4］，而星形膠質細胞上存在大量Cx43［11］。為了探討EGb761的神經保護作用是否與星形膠質細胞有直接關系，筆者利用體外培養星形膠質細胞OGD/R損傷模型模擬機體缺血/再灌注損傷。本實驗中，星形膠質細胞在OGD/R后，細胞形態發生明顯改變，出現胞體脫落，突起減少、斷裂，相互間交聯減少，大量細胞崩解死亡。LDH漏出明顯增加，細胞活性降低，也印證了星形膠質細胞嚴重損傷。EGb761能在一定質量濃度范圍內刺激細胞增殖，并使OGD導致的LDH漏出減少，細胞活性增高，減輕細胞損傷，從細胞形態觀察上也證實了這一點。同時，Hoechst 33258染色觀察到OGD/R損傷可導致星形膠質細胞凋亡增多，而EGb761則能夠減少OGD/R誘導的凋亡。

細胞凋亡與許多疾病的發生密切相關，bcl-2基因家族在細胞凋亡調控中具有重要作用，其家族主要包括抑制凋亡基因，如bcl-2和促進凋亡基因，如bax等。一般認為bcl-2與bax形成異源二聚體調節線粒體結構與功能的穩定性，調控線粒體促凋亡因子（如Cytc）的釋放，從而構成重要的細胞凋亡調控點之一［12-13］。bcl-2/bax的相對比例決定了細胞在接受凋亡信號后是否發生凋亡［14］。本實驗結果顯示細胞經OGD/R損傷后，促凋亡基因bax蛋白表達增高，EGb761能下調bax蛋白表達。相對bax表達變化，bcl-2變化較不明顯，但bcl-2/bax比值變化明顯。OGD/R損傷可使bcl-2/bax比值明顯增高，給予EGb761則明顯逆轉這種趨勢。因此，推測EGb761抑制OGD/R誘導凋亡的機制可能與調節bcl-2、bax蛋白表達，調整bcl-2/bax之間的平衡有密切關系。

細胞凋亡雖然受高度程序化調控，但最終將由凋亡執行蛋白caspase-3來啟動凋亡程序，caspase-3激活導致DNA斷裂，核染色質濃縮，細胞凋亡［15-16］。由實驗可知，OGD/R誘導可使caspase-3表達增加約2.5倍，EGb761可使OGD/R損傷后的細胞caspase-3表達量顯著降低。結果表明EGb761可抑制caspase-3激活從而對抗OGD/R誘導的星形膠質細胞凋亡，這可能是其抗細胞凋亡作用機制的環節之一。

綜上所述，EGb761能夠改善OGD/R誘導的星形膠質細胞損傷而發揮神經保護作用，這一作用的發揮可能與調整bcl-2/bax之間的比值平衡、caspase-3激活從而對抗OGD/R誘導細胞凋亡有關。

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