Nucleostemin基因及PCNA在非小細胞肺癌組織中的檢測及意義*

李向陽 錢如林 賈向波 崔東 劉鳳娟 張會民 王珂

肺癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤，該疾病所導致的死亡率和發病率都呈現出了明顯的上升趨勢。NS屬于一種p53結合蛋白，主要存在于腫瘤、變異細胞和干細胞之中，有助于腫瘤細胞和干細胞繼續增殖作用的維持[1]。而未獲得NSCLC的清除表達的情況下，NS表達量的提高會受到多種腫瘤惡性程度的影響。本次臨床研究通過免疫組織化學SP法對NS基因在NSCLC和癌旁正常組織中的表達進行了檢測和分析，現將本次臨床研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月-2012年1月在本院接受手術治療且病理檢查證實為非小細胞肺癌的53例患者為觀察對象，男31例，女22例，年齡37～76歲，平均（75±12.3）歲。其中腺癌23例，鱗癌30例。所有患者術前均未接受放療和化療治療。患者組織學分級結果為：低分化18例，中分化25例，高分化10例。依據國際抗癌聯盟（UICC）制定的TNM分期標準，Ⅲ期15例，Ⅱ期34例，Ⅰ期4例。同時選擇15例癌旁（>4 cm）經病理證實的正常肺組織作為對照組。

1.2 方法 本次臨床研究選用北京中山生物技術有限公司生產的SP試劑盒和兔抗人FHIT多克隆抗體，所有患者均在正常組織切緣或原發灶癌組織中獲取組織樣品，使用10%福爾馬林將組織固定，4 μm連續切片，石蠟包埋，并同時實施免疫組化SP法染色和HE染色。免疫組織化學NS基因蛋白表達的具體檢測方法為：連續切片組織蠟塊，厚度控制為4 Lm，組織樣品常規脫蠟至水，并使用pH為6.1的枸櫞酸鹽緩沖液0.101 mmol/L微波熱修復組織樣品。其余免疫組化染色嚴格執行試劑盒相關說明。鼠抗人NS抗體行1B100稀釋，濃度控制在10 Lg/mL左右，37 ℃中連續孵育2.5 h，使用DAB進行顯色處理，通過顯微鏡對反應時間進行控制，顯色過程通過自來水終止，復染蘇木精。所有染色均設置陰性和陽性對照，陽性對照為已知的陽性組織切片，陰性對照為PBS替代一抗。隨機選擇5個視野，在高倍鏡下觀察NS蛋白陽性表達定位于細胞質，每個視野選擇200個細胞進行計算，共計算1000個細胞。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計數資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組NS蛋白表達率比較 癌旁正常組織中NS蛋白的表達率為0（0/15），而NSCLC組織中NS蛋白的表達率達到54.7%（29/53），癌旁正常組織中NS蛋白的表達率明顯低于NSCLC組織，比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 鱗癌組織和腺癌組織中NS蛋白表達率比較 鱗癌組織中NS蛋白表達率僅為46.7%（14/30），而腺癌組織中NS蛋白表達率達到65.2%（15/23），腺癌組織中NS蛋白表達率明顯高于鱗癌組織，比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 高、中分化組織和低分化組織中NS蛋白表達率比較高、中分化組織中NS蛋白表達率為42.9%（15/35），而低分化組織中NS蛋白表達率為77.8%（14/18），高、中分化組織中NS蛋白表達率明顯低于低分化組織，比較差異均有統計學意義（P<0.05），同時，患者的淋巴結轉移情況以及TNM分期結果對其NS蛋白表達率無明顯影響（P>0.05）。

2.4 兩組間PCNA表達情況 PCNA均在細胞核中以均勻分布方式進行表達，陽性表達標準是細胞核內出現棕黃色顆粒物。所有均于細胞核中均勻分布，陽性表達為細胞核中有出現。癌旁正常組織PCNA陽性率為6.7%（1/15），NSCLC組織中PCNA陽性率為71.7%（38/53），對比可知，NSCLC患者PCNA陽性率顯著高于癌旁正常組織，比較差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

正常的細胞組織經過一系列多階段、長時間的演變，會逐漸形成一種疾病狀態，進而發展稱為腫瘤細胞，在這一復雜且漫長的演變過程中，很多細胞蛋白和基因等物質都會起到十分重要的作用[2]。醫學研究結果證實，NS蛋白能夠利用p53通路來對細胞周期產生調節作用，從而對細胞的分化和增殖產生直接影響，NS蛋白表達率通過通過雜合子基因敲出和RNA干擾實驗等過程逐漸降低，進而提高細胞的衰老速度，控制細胞增殖，所以，醫學上常將NS蛋白視為調節細胞增殖過程的主要因素。近年來的醫學研究結果表明，在蛋白水平和RNA方面，NS在多種原發癌和腫瘤細胞系中為高表達狀態，而在定型終末分化細胞中則無表達[3]。

腫瘤細胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作為評價細胞增殖狀態的指標。因此，國內外在許多腫瘤中進行了PCNA的研究，涉及PCNA與腫瘤發生發展、分級、分期、放療敏感性、預后、復發和轉移、死亡原因、腫瘤標志物等各個方面的相關性，得出了許多結論。PCNA是一種細胞周期蛋白，作為DNA聚合酶的輔助蛋白直接參與細胞增殖過程中的DNA復制，其合成和表達與細胞增殖周期相關。在細胞周期的G1期和S期早期合成，S期達高峰，G2期下降，核分裂期最低，故能反映全部細胞的增殖情況，代表細胞增殖狀態。PCNA表達異常可引起細胞周期的失控，是細胞異常增殖和癌變的原因之一。

本次臨床研究結果顯示，癌旁正常組織中NS蛋白表達明顯低于NSCLC組織。NS高表達的可能原因在于NSCLC所導致的早期事件，NSCLC組織中NS蛋白高表達，會提高細胞組織能力，并導致其發生癌變，逐步增強正常組織細胞轉化為惡性的能力，最終誘發惡性腫瘤[4-5]。由此可知，在NSCLC發生過程中，NS蛋白表達減少具有一定的影響，通過免疫組化檢測技術與纖維支氣管鏡活檢相結合的方式獲得NS蛋白表達，有助于早期發現NSCLC，進而有助于NSCLC早期診斷率的提高[6]。另一方面，NSCLC的分化程度與NS蛋白表達無直接聯系，高中分化組織中NS蛋白表達明顯低于低分化組織，且NS蛋白表達率越高，組織分化程度越低。因為腫瘤細胞存在NS擔保高表達現象，并導致腫瘤細胞在G2/M和G1/S、兩個細胞周期階段躍遷，在腫瘤細胞的細胞周期循環過程中，細胞會逐漸增殖，進而會阻斷細胞的深入分化，提高細胞的有絲分裂速度。在細胞惡性增殖過程中，NS基因具有十分重要的作用，因而能夠將NS高表達視為腫瘤細胞惡性程度的評價指標[7]。另一方面，NSCLC患者PCNA陽性率顯著高于癌旁正常組織（P<0.05），由此可見，PCNA表達可直接反映腫瘤細胞DNA復制活躍程度，在腫瘤惡性程度判定中具有重要價值。NSCLC患者肺癌分化程度、淋巴結轉移與否和PCNA陽性表達水平間關系密切[8-10]，因此PCNA表達可對肺癌患者展開個體化治療發揮有效指導作用，同時在判斷腫瘤預后質量中有重要意義。

綜上所述，NSCLC患者非小細胞肺癌組織中，NS基因mRNA和蛋白存在明顯的高表達趨勢，PCNA陽性率顯著增高，有利于腫瘤細胞惡性增殖，因而是一種臨床應用價值較高的腫瘤分子標志物。

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