冠心病患者血清中HB-EGF、TGF-β1的表達*

劉一劍 譚祖松 鄧晉 黃琿 馮宏達 謝哲 游詠

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是一組因冠狀動脈粥樣硬化致使血管腔狹窄、阻塞或功能性改變如冠脈痙攣導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病變，是動脈粥樣病變中最常見的類型，也是嚴重危害人類健康的常見病。其病理改變在本質上是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）。然而AS的發病機制至今尚未明確。近年來，國外相關研究顯示，HBEGF在肺組織、骨骼肌組織、腦組織、心肌組織、脂肪組織等多個組織中表達，尤其在脂肪組織中高表達，具有廣泛的生物學活性，然國內對該研究仍不多。TGF-β1參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和狹窄、心肌梗死后重塑、細胞凋亡等過程，是冠心病領域研究的熱點，但在冠心病過程中的作用尚未完全闡明，仍有爭議[1-3]。本實驗通過RT-PCR技術分析HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA在冠心病患者血清中的表達情況，進一步分析兩者在動脈粥樣硬化發生、發展中的作用，希望能為冠心病從分子基因水平的防治提供新思路、新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南華大學第一附屬醫院2012年-2013年住院病例，入院診斷考慮冠心病并通過冠狀動脈造影確診患者60例，其中ACS組30例、SAP組30例，并選取同期經詳細詢問病史、體格檢查及胸片、心電圖、血、尿、大便常規、血生化檢查均未見異常及選擇性冠脈造影（CAG）無血管病變者出院修正診斷為健康人或心臟神經官能癥20例作為對照組（NC組）。所有入組病例均排除嚴重肝腎腦肺疾病、嚴重瓣膜性心臟病、心肌病、風心病、肺源性心臟病患者、重癥感染、甲亢、活動性結核、近1個月內應用激素或其他免疫抑制劑、腫瘤、自身免疫疾病、感染性疾病或感染急性期、銀屑病、妊娠、近期皮膚及組織損傷等病患。

1.2 試劑 血液RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq MasterMix逆轉錄試劑盒、100bp Ladder Marker試劑盒（上述試劑均購自北京康為世紀生物公司）；PCR引物及PCR反應體系mix由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CHD診斷標準 按2007年美國心臟病學會（American College of Cardiology，ACC）/美國心臟協會（American Heart Association，AHA）冠心病指南的診斷標準。

1.3.2 基本指標的測量 身高及體重測量：要求選用同一身高體重計測量，所有對象均應于清晨空腹狀態下，穿單衣單褲、赤腳，腳跟、骶骨部及兩肩胛間緊靠身高計立柱上。連續測兩次取其平均值。計算體重指數（BMI 體重公斤數除以身高米數平方）。血壓測量：所有對象均應于清晨醒后、空腹未服用藥物、情緒平穩、未運動狀態下測量，連續3 d清晨測量2次，取平均值；測量方法：選用汞柱式血壓計，根據柯氏音第一音及消失音時水銀柱凸面相應垂直高度紀錄相應收縮壓及舒張壓，取平均動脈壓（MAP），平均動脈壓=（收縮壓+2×舒張壓）/3。

1.3.3 血脂測定 所有患者均于入院后第1天清晨空腹采外周靜脈血，測定其甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白膽（LDL），所有標本使用德國羅氏全自動生化儀測定。

1.3.4 外周血提取RNA 所有患者均取自于外周動脈血（用檸檬酸鹽、EDTA或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品），所取標本按購買試劑盒說明書嚴格執行RNA提取，提取過程中保持無菌原則，取1 μL RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。并予紫外分光光度計準確定量，要求OD260/OD280于1.8～2.2之間。

1.3.5 RNA逆轉錄成cDNA 提取RNA后立即行逆轉錄，按逆轉錄試劑盒說明書嚴格執行，所得逆轉錄產物保存于-20 ℃冰箱。

1.3.6 RT-PCR 收集所有標本后進行RT-PCR。PCR總反應體系為20 μL，其中逆轉錄產物2 μL、Mix 10 μL、各基因上、下游引物分別1 μL、RNase-Free Water 6 μL。HBEGF反應參數：94 ℃變性5 min后進行30個循環，循環條件：94 ℃ 30 s，49 ℃ 40s，72 ℃ 40 s；最后 72 ℃終延伸 2 min。TGF-β1反應參數：94 ℃變性5 min后進行30個循環，循環條件：94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，最后 72 ℃終延伸2 min。內參β-actin反應參數：94℃變性4 min后進行26個循環，循環條件：94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物直接用于下列電泳或4 ℃保存。PCR儀（型號：德國biometra T-Gradient），見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.7 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳及結果分析 配制1.5%瓊脂糖凝膠，取PCR目的基因產物及β-actin各3 μL點樣后進行電脈，設置恒壓為90 V，約30 min后結束電泳，用凝膠成像分析系統（型號：美國alpha3400）觀察結果，拍照后測定DNA擴增帶光密度值，取目的基因光密度值與相應β-actin光密度值之比作為統計參數。

1.4 統計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料用（±s）表示，實驗組與對照組間檢驗其正態性方差齊性，各組之間采用兩獨立樣本t檢驗、單因素方差分析，并采用Pearson相關分析、Spearman等級相關法對其他可能相關因素進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHD組與NC組比較 CHD組患者中HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA明顯高于對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 ACS組與SAP組各項指標比較 ACS組患者中HBEGF mRNA及TGF-β1mRNA明顯高于SAP組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表3及圖1-2。

2.3 HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA在血清中表達與血壓、血脂的相關性 結果示體重指數、平均動脈壓、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白與HB-EGF mRNA表達無明顯相關性，亦與TGF-β1mRNA表達無明顯相關性，見表4。

3 討論

HB-EGF是表皮生長因子家族成員之一，是多種類型細胞有絲分裂原，亦涉及許多生理和病理過程，包括心臟發育及心肌修復、心肌肥大、皮膚傷口愈合、眼瞼形成、腎集合管生成、胚泡著床、肺動脈高壓、腫瘤形成等。HB-EGF在動脈粥樣硬化、平滑肌細胞增生中有重要作用。研究表明，HB-EGF與胞膜上表皮生長因子受體（EGFR）、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）緊密結合，通過蛋白激酶C和Ca2+等信號途徑發揮作用，促進平滑肌細胞、上皮細胞、系膜細胞、纖維細胞等多種細胞增生[4]。Kishida K等[5]人研究發現，在AS斑塊組織中，HB-EGF在VSMC和巨噬細胞的表達顯著提高，促進動脈硬化，而在非AS成人動脈中，內膜平滑肌細胞HB-EGF呈均勻分布，且隨著年齡的增加而緩慢增加。Reape等[6]在AS斑塊組織HB-EGF的表達和定位的研究中發現，對比正常和AS的血管壁，HB-EGF mRNA只在AS組織和用其培養的VSMC中表達，在巨噬細胞中高表達。本實驗最后結果證實，在冠心病患者血清中，HB-EGF在基因轉錄水平較正常對常組明顯增高。還發現HB-EGF的信號通道比較復雜，近年來HB-EGF與腫瘤和心血管疾病的發生機制的研究日趨活躍，通過對信號通道的研究有望開發出以HB-EGF為靶向因子的新型藥物治療方式。最新的兩項關于動脈粥樣硬化免疫組化的臨床研究均發現[7-8]，HB-EGF

在斑塊局部呈陽性表達，證實HB-EGF能刺激平滑肌細胞細胞的增殖，遷移，從而在動脈粥樣硬化形成的過程中發揮作用。這與本文的研究結果一致。因此，筆者可以推斷在動脈粥樣硬化斑塊的發展過程中，HB-EGF可作為動脈粥樣硬化治療的一個新的靶點。

表2 CHD組與NC組各項指標比較

續表2

表3 ACS組與SAP組各項指標比較

續表3

圖1 ACS、SAP、NC血清中HB-EGF mRNA表達情況

圖2 TGF-β1 mRNA表達情況

表4 HB-EGF mRNA及TGF-β1 mRNA在血清中表達與血壓、血脂及兩者之間的相關性分析

TGF-β1是TGF-β超家族成員之一，其參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和狹窄、心肌梗死后重塑、細胞凋亡等過程，是冠心病領域研究的熱點，但在冠心病過程中的作用尚未完全闡明且有較多爭議。Argmann等[9]在小鼠動脈粥樣硬化模型中發現，TGF-β1可以抑制巨噬細胞LDL殘體或氧化的極低LDL殘體，減少高密度脂蛋白（HDL）與巨噬細胞和泡沫細胞的結合。Kenny等[10]在反復阻塞和再灌注發作時冠狀動脈內注射TGF-β1，明確發現可以誘導血管壁細胞的分化，促進微血管成熟和血管新生。Tashiro等[11]研究證實低水平的TGF-β1可促進PDGF-α的表達，介導平滑肌細胞的遷移和增殖；當其水平較高時，平滑肌細胞表面的PDGF受體α亞單位的表達受抑制，抑制平滑肌細胞的增殖；其不僅能調節平滑肌細胞的遷移與增殖，而且能調節平滑肌細胞表型的轉變，對動脈脈粥樣硬化起到保護作用。本研究最后結果進一步映證，冠心病患者血清中TGF-β1表達明顯較對照組明顯降低，提示高水平的TGF-β1對冠心病患者可有一定保護作用。

不穩定性粥樣斑塊破裂或脫落并繼發性出血栓形成是急性冠脈綜合征的重要病理基礎，不穩定性斑塊所占比例越高，發生ACS可能越大。不穩定斑塊多為薄而偏心性纖維帽，內含有大片脂質壞死中心并有大量炎性細胞浸潤，細胞外基質及平滑肌細胞很少。而纖維帽厚，脂質壞死中心小，基質及平滑肌細胞多而炎性細胞少的斑塊強度大，不易破裂，發生ACS事件偏少。Ross[12]教授提出“AS是一種炎癥性疾病”學說，指出AS是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，其發展始終伴隨炎癥反應。研究表明，TGF-β1可在體內發揮強大的非特異性抗炎作用[13-14]。本研究結果提示在ACS組患者中，其TGF-β1表達較SAP組患者明顯偏低，提示TGF-β1可能參與AS炎癥過程，進一步印證Ross教授的“AS是一種炎癥性疾病”學說。

綜上所述，HB-EGF在冠心病患者中明顯增高，其可能作為其發生、發展過程中獨立危險因素而存在。而TGF-β1則可能AS發生、發展過程發揮獨特抗炎作用。本研究結果提示，血脂及血糖與HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA并無明顯相關聯系。因入院前患者有部分服用降脂藥物及飲食中糖及脂含量未做進一步統計分析，仍須在臨床工作中進一步分析觀察。同時對其相關機制仍須進一步研究探討。

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