MicroRNA及其在黑素瘤中作用的新認識

范芙蓉

黑素瘤（melanoma）又稱惡性黑素瘤（malignant melanoma，簡稱惡黑）是最具侵襲性的一種高度惡性、易遠處轉移的皮膚腫瘤[1]，起源于黑素細胞，多發生于皮膚，亦可見于皮膚黏膜交界處、眼球脈絡膜和軟腦膜等處，死亡率高。早期惡黑以手術治療為主，預后較好，晚期轉移性惡黑因對放療，化療及生物治療均不甚敏感，其中位生存期6～9個月，5年生存率<5%[2]，預后差。近幾年來，其發病率逐年升高，年增長率約3%[3]。MicroRNA（miRNA）是一類長約18～22個核苷酸（nt）的非編碼單鏈小分子RNA，參與生物體一系列生物學過程，在細胞生成、繁殖、代謝、凋亡和腫瘤生成等方面廣泛、精確地調控靶基因并影響其表達。miRNA在人體最大的器官——皮膚中也起著重要作用[4]。miRNA的異常表達，被認為與惡黑的發生、發展等密切相關。Worly等[5]在研究葡萄膜惡黑中認為，miRNA的表達有可能成為預測其轉移風險的生物學指標。

1 miRNA的生物學特征及其生成與作用機制

近年來，miRNA已成為生命科學研究的熱點，自1993年在果蠅中發現第一個miRNA以來，迄今已有15 172個miRNA相繼在脊椎動物、蠕蟲、果蠅、植物和病毒等142個物種被發現，通過克隆技術（cloning technology）、深度測序（deep sequencing） 以及復雜的生物信息學和遺傳篩選等方法，發現并鑒定人類基因組織中可能存在約1000個miRNA，調節人類近30%基因表達。約有超過50%的miRNA定位于腫瘤相關的脆性位點（fragile site）[6-7]。參與生命過程中一系列重要進程，包括發育、繁殖、分化和凋亡等。

1.1 miRNA的生物學特征 （1）是一組內源性非編碼，長度為18～22 nt的單鏈小分子，廣泛存在于動、植物及病毒等的真核細胞中，具有高度保守性，其本身不具有開放閱讀框架。（2）結構上，miRNA為單鏈結構，在3’端有1～2個堿基的長度變化，5’端有一磷酸基團，3’端為羥基，該結構所具有的特點使其與功能RNA的降解片段和大多數寡核苷酸保特區別。（3）miRNA具有較強的同源性，來自不同基因簇的RNA同源性較弱，其表達具有組織特異性和時序特異性[7]。

1.2 miRNA的生成及作用機制 MiRNA的生成過程包括轉錄、加工成熟及功能復合體裝配等主要程序。近期研究表明，miRNA的生成和作用大致經歷兩個階段[8]，即RNA聚合酶2作用于miRNA基因，轉錄生成初級miRNA（pri-miRNA），再由RNA聚合酶3-Dorsha-DGCR8復合體切割形成前體miRNA（pri-miRNA），在細胞內完成；聚合酶3、旋解酶及核酸酶Dicer（屬于Rnase3家族）共同作用于pre-miRNA，將其剪切為雙鏈miRNA，隨后雙鏈miRNA被降解，一條5’端不穩定的鏈被結合到核蛋白復合體并參與形成由RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing compley， RLSC）[9]，另一條鏈隨即被降解，進入RLSC的miRNA直接與Ago（Argonaute）家族的蛋白質結合，作為“向導”分子介導RLSC剪切靶基因mRNA使其降解或結合到靶基因mRNA的3，UTR（3’端非翻譯區）翻譯，從而在生物學過程中發揮多種功能[7]。

2 miRNA在腫瘤發生發展中的作用

miRNA通過靶基因3’UTR序列結合，以抑制翻譯或降解miRNA的兩種方式，在轉錄后水平調控基因表達，其與腫瘤的發生發展有著密切的關系。雖然大約逾半數的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點，但表觀遺傳學（epigenetics）的調控及miRNA的單核苷酸的多態性（SNP）均參與了腫瘤發生過程中miRNA的表達變化，亦是腫瘤發生發展的重要因素。研究表明，通過調控靶基因的表達，miRNA參與一系列生理病理過程，包括調節細胞自我更新、凋亡、干細胞分化和腫瘤的發生及轉移等[10]。miRNA在腫瘤中的異常表達有兩種表現，即上調和下調miRNA，從而發揮癌基因和抑癌基因的雙重作用。Calin等[11]認為，miRNA可通過類似癌基因和抑癌基因的作用參與腫瘤發生發展和轉歸過程。具有癌基因作用的miRNA通常處于靜止或低表達狀態，其活化可導致癌變，在腫瘤組織中，某些miRNA表達水平明顯上調表現出癌基因的特征，如miR-21、miR-221、miR-222類似癌基因的功能[12]；具有抑癌基因作用的miRNA可抑制細胞的過度生長和繁殖，遏制腫瘤形成，如miR-143、miR-145類似于抑癌基因的功能[13]，其失活亦可導致腫瘤的發生。let-7是最早被證實與腫瘤形成相關的miRNA。近期的研究表明，let-7家族為miRNA的一種，許多腫瘤往往丟失let-7的表達調控作用，故被視為抑癌基因，恢復let-7家族的表達在癌癥治療中具有重要意義[14]。Trang等[15]在非小細胞肺癌小鼠模型內導入外源性let-7結果中發現let-7可有效抑制腫瘤的發展。

3 miRNA在惡黑中的作用

3.1 惡黑與let-7 業已證實，let-7家族成員在惡黑發生發展中發揮了重要作用。研究發現，let-7家族中的5個成員在惡黑中顯著下調，let-7b可能是通過抑制惡黑周期過程而發揮負向調節惡黑細胞生長和繁殖，其表達可下調細胞周期蛋白依賴激酶4（cdk4）和周期素D1、D3、A的表達，從而明顯減少處于S期的惡黑細胞數量、增加處于G1期的惡黑細胞數量并減少惡黑細胞的依賴性增長[16]。Müller等[17]研究表明，整合素β3在惡黑進展浸潤中具有重要作用，let-7通過與整合素β3的3’UTR結合而調節其表達，let-7a的表達缺失是調控整合素β3在惡黑細胞中表達增加的主要機制，而整合素β3表達增加可誘導惡黑進展浸潤與侵襲。Let-7a的表達缺失通過增長整合素β3的表達參與了侵襲性惡黑的發生和發展。

3.2 惡黑與miR-221，miR-222 研究表明，在原代培養的惡黑細胞中，Dicer，Argo2及許多miRNA表達異常[18]。miR-221、miR-222在惡黑中均發揮類似癌基因作用[12]。它們可通過下調P27kip/cokNIB與C-KLT受體兩條信號通路，間接調控小眼球相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor， MITF），保進黑素細胞的惡化，而MIFT與黑素細胞的增殖、凋亡、成熟、黑素生成等相關，并能調節惡黑細胞凋亡抑制因子（ML-IAP）[19]。Felicetti等[20]研究表明，miR-221與miR-222可下調早幼粒白血病鋅指基因（premyelocytic leukemia zinc finger， PLZF）這個抑癌基因，該基因轉錄因子直接通過與miR-221與miR-222的調節區結合增加其下游的促癌因子如N-Ras、Ref、C-myc、cyclins D1/D3和cdk4的表達，促進惡黑的生成和發展。

3.3 惡黑與miR-137、miR-182 miR-137在惡黑細胞中可靶向調節MITF，并下調MITF的表達，并證實后者是miR-137的靶基因，miR-137能抑制MITF表達，而后者是黑素細胞發育成熟、細胞凋亡和黑素沉著的主要調節因子[21]。Segura等[22]研究發現，miR-152的異位表達能增強惡黑細胞的運動能力和轉移性，其表達下調則可阻礙惡黑細胞的侵襲和誘導凋亡。miR-182過表達可直接抑制MITF和人叉頭框蛋白03（FOX03），從而促進惡黑細胞的生存和運動，相反，后兩者的增強表達可阻礙miR-182的作用。已經證實，MITF和FOXO3是miR-182調控的靶基因，在人類組織中，miR-182的表達水平隨惡黑惡性程度增加而升高，而MITF和FOXO3水平則恰好相反。

目前，miRNAs在惡黑中的調控機制尚未完全闡明。與惡黑相關的主要表達譜及其靶基因與作用機理，通過基礎和臨床研究正在不斷更新。未來，尋找和研究在惡黑中用于早期診斷和鑒別診斷的miRNAs生物學標志物將深入開展。Love等[23]指出，由于皮膚的易于吸收藥物的特性，因此闡明miRNAs信號通路的途徑必將開創下一個基于miRNAs藥物治療的新時代，可以相信，miRNAs做為惡黑診斷和治療新靶標的前景將十分光明和誘人。

[1]Lin L T， Liu C B， Chen S N， et al. Primary malignant melanoma of the vagina with repeated local recurrences and brain meastasis[J]. J Chin Med Assoc，2011，74（8）：376-379.

[2]Jemal A， Siegel R， Ward E， et al. Cancer statistics， 2008[J]. CA Cancer J Clin，2008，58（2）：71-96.

[3]Garbe C， Peris R， Hauschild A， et al. Diagnosis and treatment of melanoma： european consensus-based interdisciplinary guideline[J].Eur J Cancer，2010，46（2）：270-283.

[4]Sand M， Gambichler T， Sand D， et al. MicroRNAs and the skin： tiny players in the body’s largest organ[J]. J Dermatol sci，2009，53（3）：169-175.

[5]Worley L A， Long M D， Onken M D， et al. Micro-RNAs associated with metastasis in uveal melanoma identified by multiplexed microarray profiling[J]. Melanoma Res，2008，18（3）：184-190.

[6]Lee Y S， Dutta A. MicroRNAs in cancer[J]. Annu Rev Pathol，2009，4（2）：199-277.

[7]沙龍澤，曾毅，王建博，等.小RNA分子研究進展[J].生物學通報，2009，44（1）：1-5.

[8]Umbach J L， Kramer M F， Jurak I， et al. MicroRNAs expressed by herps simplex virus I during latent infection regulate viral mRNAs[J].Nature，2008，454（7205）：780-783.

[9]Fasanaro P， Greco S， Ivan M， et al. MicroRNA： Emerging therapeutic targets in acute ischeminc diseases[J]. Pharmacol Ther，2010，125（1）：92-97.

[10]Zimmerman A L， Wu S. MicroRNAs， cancer and cancer stem cells[J].Cancer Lett，2011，300（1）：10-19.

[11]Calin G A， Croce C M. MicroRNA-cancer connection： the beginning of a new tale[J]. Cancer Res，2006，66（15）：7390-7394.

[12]Si M L， Zhu S， Wu H， et al. MiR-21-mediated tumor growth[J].Oncogene，2007，26（19）：2799-2803.

[13]Akao Y， Nakagawa Y， Kitade Y， et al. Downregulation of microRNAs-143 and-145 in B-cell malignancies[J]. Cancer Sci，2007，98（12）：1914-1920.

[14]Landi M T， Zhao Y， Rotunno M， et al. MicroRNA expre-ssion differentiates histology and predicts survival of lung cancer[J]. Clin Cancer Res，2010，16（2）：430-441.

[15]Trang P， Medina P P， Wiggins J F， et al. Regression of murine lung tumors by the let-7 microRNA[J]. Oncogene，2010，29（11）：1580-1587.

[16]Schultz J， Lorenz P， Gross G， et al. MicroRNA let-7b targets important cell cycle molecules in malignant melanoma cells and interferes with anchorage-independent growth[J]. Cell Res，2008，18（5）：549-557.

[17]Müller D W， Bosserhoff A K. Integrin beta 3 expression is regulated by let-7a miRNA in malignant melanoma[J]. Oncogene，2008，27（52）：6698-6706.

[18]Zhang L， Huang J， Yang N. et al. microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（24）：9136-9141.

[19]Felicetti F， Errico M C， Bottero L， et al. The promyelocytic leukemia zinc finger-microRNA-221/-222 pathway controls melanoma progression through multiple oncogenic mechanisms[J]. Cancer Res，2008，68（8）：2745-2754.

[20]Felicetti F， Bottero L， Felli N， et al. Role of PLZF in melanoma progression[J]. Oncogene，2004，23（26）：4567-4576.

[21]Bemis L T， Chen R， Amato C M， et al. MicroRNA-137 targets microphthalmia-associated transcription factor in melanoma cell lines [J]. Cancer Res，2008，68（5）：1362-1368.

[22]Segura M F， Hanniford D， Menendez S， et al. Aberrant miR-182 expression promotes melanoma metastasis by repressing FOXO3 and microphthalmia-associated transcription factor[J]. Proc Natl Acad sci USA，2009，106（6）：1814-1819.

[23]Love T M，Moffett H F， Novina C D. Not miR-1y small RNAs：big potential for microRNAs in therapy[J]. J Allergy Clin lmmunol，2008，121（2）：309-319.